Ablações de volume profunda e espacialmente controladas usando um microscópio de dois fótons no Gás de Peixe-Zebra

As interações célula-célula desempenham papéis vitais no desenvolvimento. As células fornecem sinais que seus vizinhos diretos, ou células mais distantes, podem perceber, influenciando assim seu destino e/ou comportamento. Muitos desses sinais são de natureza química. Por exemplo, nos eventos de indução bem caracterizados, um grupo celular produz moléculas difusíveis que afetam o destino de outra população ^celular1. Outros sinais, no entanto, são mecânicos; as células exercem forças e restrições sobre seus vizinhos, que os vizinhos percebem e respondem ^a2.

Uma forma de estudar a importância dessas interações célula-célula in vivo é eliminar algumas células e observar o desenvolvimento subsequente. Infelizmente, as técnicas disponíveis para remover ou destruir células são limitadas. As células podem ser removidas ^{cirurgicamente3,4}, usando agulhas ou pequenos fios, mas tais tratamentos são invasivos, não muito precisos, e geralmente realizados sob um estereoscópio, impedindo imagens imediatas sob um microscópio. Além disso, mirar células profundas implica perfurar um buraco em tecidos sobrelvando, criando perturbações indesejadas. Fotosensibilizadores geneticamente codificados, como KillerRed, têm sido usados para induzir a morte celular através da iluminação ⁵. Fotosensitizers são cromóforos que geram espécies reativas de oxigênio após a irradiação da luz. Sua principal limitação é que eles requerem longas iluminação luminosas (cerca de 15 minutos), o que pode ser difícil de alcançar se as células estão se movendo, e que induzem a morte celular através da apoptose, o que não é imediato.

Finalmente, as ablações a laser foram desenvolvidas e amplamente utilizadas nos últimos 15 anos6,7,8,9,10,11,12. Um raio laser é focado na célula/tecido alvo. Induz sua ablação através do aquecimento, fotoblação ou ablação induzida pelo plasma; o processo envolvido depende da densidade de energia e do tempo de ^{exposição13}. A maioria dos protocolos de ablação usam lasers UV para sua alta energia. No entanto, a luz UV é absorvida e espalhada por tecidos biológicos. Assim, mirar células profundas requer uma alta potência laser, que então induz danos em tecidos mais superficiais e fora do avião. Isso limita o uso de lasers UV para estruturas superficiais e explica sua resolução axial relativamente baixa. A óptica não linear (a chamada microscopia de dois fótons) usa propriedades não lineares de luz para excitar um fluoróforo com dois fótons de aproximadamente metade da energia no domínio infravermelho. Quando aplicado a ablações, isso tem três principais vantagens. Primeiro, a luz infravermelha é menos dispersa e menos absorvida do que a luz UV por tecidos ^{biológicos14}, permitindo alcançar estruturas mais profundas sem aumentar a potência laser necessária. Em segundo lugar, o uso de um laser pulsado femtosegundo fornece densidades de energia muito altas, criando uma ablação através da indução plasmática, que, ao contrário do aquecimento, não difunde ^{espacialmente15}. Em terceiro lugar, a densidade de energia induzindo a formação plasmática é alcançada apenas no ponto focal. Graças a essas propriedades, as ablações a laser de dois fótons podem ser usadas para atingir precisamente células profundas sem afetar o ambiente tecidual circundante.

As migrações coletivas são um excelente exemplo de processos de desenvolvimento nos quais as interações célula-células são fundamentais. As migrações coletivas são definidas como migrações celulares nas quais as células vizinhas influenciam o comportamento de uma ^célula16. A natureza dessas interações (químicas ou mecânicas) e como elas afetam a migração celular podem variar muito e muitas vezes não são totalmente compreendidas. A capacidade de remover células e observar como isso afeta os outros é fundamental para desvendar ainda mais esses processos coletivos. Há alguns anos, estabelecemos — usando abordagens cirúrgicas — que a migração do polster durante a gastrusão de zebrafish é uma migração ^coletiva17. O polster é um grupo de células que constitui as primeiras células internalizadoras no lado dorsal do ^embrião18. Essas células, rotuladas em verde na linha transgênica Tg(gsc:GFP), estão localizadas profundamente no embrião, abaixo de várias camadas de células epiblastos. Durante a gastruação, esse grupo lidera a extensão do mesoderme axial, migrando do organizador embrionário para o polo animal19,20,21,22,23 (Figura 1A). Estabelecemos que as células precisam de contato com seus vizinhos para orientar sua migração na direção do polo animal. No entanto, entender melhor as bases celulares e moleculares dessa migração coletiva envolve a remoção de algumas células para ver como isso influencia as demais. Nós, portanto, desenvolvemos ablações de grandes e profundos volumes usando uma configuração de microscopia de dois fótons. Aqui, demonstramos o uso deste protocolo para cortar o polster em seu meio e observar as consequências na migração celular rastreando núcleos rotulados com Histone2B-mCherry.