Ablaciones de volumen profundas y espacialmente controladas utilizando un microscopio de dos fotones en la gastrula del pez cebra

Las interacciones célula-célula juegan un papel vital en el desarrollo. Las células proporcionan señales que sus vecinas directas, o células más lejanas, pueden percibir, influyendo así en su destino y / o comportamiento. Muchas de estas señales son de naturaleza química. Por ejemplo, en los eventos de inducción bien caracterizados, un grupo celular produce moléculas difusibles que afectan el destino de otra población ^celular1. Otras señales, sin embargo, son mecánicas; las células ejercen fuerzas y restricciones sobre sus vecinos, que los vecinos perciben y a los que ^responden2.

Una forma de estudiar la importancia de estas interacciones célula-célula in vivo es eliminar algunas células y observar el desarrollo posterior. Desafortunadamente, las técnicas disponibles para eliminar o destruir células son limitadas. Las células se pueden extraer ^{quirúrgicamente3,4}, utilizando agujas o alambres pequeños, pero tales tratamientos son invasivos, no muy precisos y generalmente se realizan bajo un estereomicroscopio, lo que impide la obtención de imágenes inmediatas bajo un microscopio. Además, apuntar a las células profundas implica perforar un agujero en los tejidos suprayacentes, creando perturbaciones no deseadas. Los fotosensibilizadores codificados genéticamente, como KillerRed, se han utilizado para inducir la muerte celular a través de la iluminación con ^luz5. Los fotosensibilizadores son cromóforos que generan especies reactivas de oxígeno tras la irradiación de la luz. Su principal limitación es que requieren iluminaciones de luz largas (alrededor de 15 min), lo que puede ser difícil de lograr si las células se mueven, y que inducen la muerte celular a través de la apoptosis, que no es inmediata.

Finalmente, las ablaciones con láser han sido desarrolladas y ampliamente utilizadas en los últimos 15 años6,7,8,9,10,11,12. Un rayo láser se enfoca en la célula / tejido objetivo. Induce su ablación a través del calentamiento, la fotoablación o la ablación inducida por plasma; el proceso involucrado depende de la densidad de potencia y el tiempo de ^{exposición13}. La mayoría de los protocolos de ablación utilizan láseres UV por su alta energía. Sin embargo, la luz UV es absorbida y dispersada por los tejidos biológicos. Por lo tanto, apuntar a las células profundas requiere una alta potencia láser, que luego induce daños en tejidos más superficiales y fuera del plano. Esto limita el uso de láseres UV a estructuras superficiales y explica su resolución axial relativamente baja. La óptica no lineal (la llamada microscopía de dos fotones) utiliza propiedades no lineales de la luz para excitar un fluoróforo con dos fotones de aproximadamente media energía en el dominio infrarrojo. Cuando se aplica a las ablaciones, esto tiene tres ventajas principales. En primer lugar, la luz infrarroja está menos dispersa y menos absorbida que la luz UV por los tejidos ^{biológicos14}, lo que permite llegar a estructuras más profundas sin aumentar la potencia láser requerida. En segundo lugar, el uso de un láser pulsado de femtosegundo proporciona densidades de potencia muy altas, creando una ablación a través de la inducción plasmática, que, contrariamente al calentamiento, no se difunde ^{espacialmente15}. En tercer lugar, la densidad de potencia que induce la formación de plasma se alcanza solo en el punto focal. Gracias a estas propiedades, las ablaciones con láser de dos fotones se pueden utilizar para apuntar con precisión a las células profundas sin afectar el entorno del tejido circundante.

Las migraciones colectivas son un excelente ejemplo de procesos de desarrollo en los que las interacciones célula-célula son fundamentales. Las migraciones colectivas se definen como migraciones celulares en las que las células vecinas influyen en el comportamiento de una ^célula16. La naturaleza de estas interacciones (químicas o mecánicas) y cómo afectan la migración celular puede variar mucho y, a menudo, no se entiende por completo. La capacidad de eliminar células y observar cómo esto afecta a las demás es fundamental para desentrañar aún más estos procesos colectivos. Hace unos años, establecimos, utilizando enfoques quirúrgicos, que la migración del polster durante la gastrulación del pez cebra es una migración ^colectiva17. El polster es un grupo de células que constituye las primeras células interiorizantes en el lado dorsal del ^embrión18. Estas células, marcadas en verde en la línea transgénica Tg(gsc:GFP), se encuentran en lo profundo del embrión, debajo de varias capas de células epiblásticas. Durante la gastrulación, este grupo lidera la extensión del mesodermo axial, migrando desde el organizador embrionario hasta el polo animal19,20,21,22,23 (Figura 1A). Establecimos que las células requieren contacto con sus vecinas para orientar su migración en la dirección del polo animal. Sin embargo, una mejor comprensión de las bases celulares y moleculares de esta migración colectiva implica la eliminación de algunas células para ver cómo esto influye en las restantes. Por lo tanto, desarrollamos ablaciones de volúmenes grandes y profundos utilizando una configuración de microscopía de dos fotones. Aquí, demostramos el uso de este protocolo para cortar el polster en su medio y observar las consecuencias en la migración celular mediante el seguimiento de núcleos marcados con Histone2B-mCherry.