在斑马鱼胃中使用双光子显微镜进行深度和空间控制的体积消融

细胞 – 细胞相互作用在发育中起着至关重要的作用。细胞提供信号，它们的直接邻居或更远的细胞可以感知，从而影响它们的命运和/或行为。其中许多信号本质上是化学性质的。例如，在表征良好的诱导事件中，一个细胞群产生可扩散的分子，影响另一个细胞群的命运¹。然而，其他信号是机械的。细胞对邻居施加力和约束，邻居感知并做出反应²。

研究这些细胞 – 细胞 相互作用在体内 的重要性的一种方法是消除一些细胞并观察随后的发展。不幸的是，去除或破坏细胞的可用技术是有限的。细胞可以通过手术切除^3，4，使用针头或小线，但这种治疗是侵入性的，不是很精确，通常在立体显微镜下进行，阻止在显微镜下立即成像。此外，靶向深层细胞意味着在覆盖的组织中刺穿一个洞，从而产生不必要的扰动。基因编码的光敏剂，如KillerRed，已被用于通过光照诱导细胞死亡⁵。光敏剂是在光照射下产生活性氧的发色团。它们的主要局限性是它们需要长光照明（约15分钟），如果细胞移动，这可能很难实现，并且它们通过细胞凋亡诱导细胞死亡，这不是立即的。

最后，激光烧蚀在过去15年中得到了发展和广泛的应用^6，7，^{8，9，10，11，12}。激光束聚焦在目标细胞/组织上。它通过加热，光消融或血浆诱导的消融诱导其消融;所涉及的过程取决于功率密度和曝光时间¹³。大多数烧蚀方案使用紫外激光器来实现其高能量。然而，紫外线既被生物组织吸收又被散射。因此，靶向深层细胞需要高激光功率，然后在更浅表的，平面外的组织中诱导损伤。这限制了紫外激光器在浅表结构上的使用，并解释了它们相对较低的轴向分辨率。非线性光学（所谓的双光子显微镜）使用光的非线性特性来激发荧光团，荧光团在红外域中具有大约一半能量的两个光子。当应用于消融术时，这有三个主要优点。首先，与紫外光相比，红外光的散射更少，被生物组织吸收更少¹⁴，从而可以在不增加所需激光功率的情况下到达更深的结构。其次，使用飞秒脉冲激光器可提供非常高的功率密度，通过等离子体感应产生烧蚀，这与加热相反，不会在空间上扩散¹⁵。第三，诱导等离子体形成的功率密度仅在焦点处达到。由于这些特性，双光子激光烧蚀可用于精确靶向深层细胞，而不会影响周围的组织环境。

集体迁移是发育过程的一个很好的例子，其中细胞 – 细胞相互作用是根本的。集体迁移被定义为相邻细胞影响一个细胞行为的细胞迁移¹⁶。这些相互作用的性质（化学或机械）以及它们如何影响细胞迁移可能会有很大差异，并且通常不完全理解。移除细胞并观察其如何影响其他细胞的能力对于进一步解开这些集体过程至关重要。几年前，我们使用手术方法确定，斑马鱼原肠胚形成过程中的洄游是集体迁徙¹⁷。Polster是一组细胞，构成胚胎背侧的第一个内化细胞¹⁸。这些细胞在 Tg（gsc：GFP） 转基因系中以绿色标记，位于胚胎深处，在几层外胚层细胞的下方。在原肠胚形成过程中，该组导致轴向中胚层的延伸，从胚胎组织者迁移到动物极^{19，20，21，22，23} （图1A）。我们确定细胞需要与邻居接触，以将其迁徙定位在动物极点的方向上。然而，更好地了解这种集体迁移的细胞和分子基础涉及去除一些细胞，看看这如何影响其余的细胞。因此，我们使用双光子显微镜设置开发了大而深体积的烧蚀。在这里，我们演示了使用该协议来切断中间的polster，并通过跟踪用Histone2B-mCherry标记的细胞核来观察对细胞迁移的影响。