Diepe en ruimtelijk gecontroleerde volume-ablaties met behulp van een twee-fotonenmicroscoop in de zebravis Gastrula

Cel-cel interacties spelen een vitale rol in de ontwikkeling. Cellen geven signalen die hun directe buren, of cellen verder weg, kunnen waarnemen, waardoor hun lot en/of gedrag wordt beïnvloed. Veel van deze signalen zijn chemisch van aard. Bijvoorbeeld, in de goed gekarakteriseerde inductiegebeurtenissen produceert een celgroep diffuusibele moleculen die het lot van een andere celpopulatie ^{beïnvloeden1}. Andere signalen zijn echter mechanisch; cellen oefenen krachten en beperkingen uit op hun buren, die de buren waarnemen en waarop ze ^reageren2.

Een manier om het belang van deze cel-cel interacties in vivo te bestuderen, is door sommige cellen te elimineren en de daaropvolgende ontwikkeling te observeren. Helaas zijn de beschikbare technieken om cellen te verwijderen of te vernietigen beperkt. Cellen kunnen chirurgisch worden ^{verwijderd3,4}, met behulp van naalden of kleine draden, maar dergelijke behandelingen zijn invasief, niet erg nauwkeurig en worden meestal uitgevoerd onder een stereomicroscoop, waardoor onmiddellijke beeldvorming onder een microscoop wordt voorkomen. Bovendien impliceert het richten op diepe cellen het doorboren van een gat in bovenliggende weefsels, waardoor ongewenste verstoringen ontstaan. Genetisch gecodeerde fotosensitizers, zoals KillerRed, zijn gebruikt om celdood te induceren via ^{lichtverlichting5}. Fotosensitizers zijn chromoforen die reactieve zuurstofsoorten genereren bij lichtbestraling. Hun belangrijkste beperking is dat ze lange lichtverlichting nodig hebben (ongeveer 15 minuten), wat moeilijk te bereiken kan zijn als cellen bewegen, en dat ze celdood induceren door apoptose, wat niet onmiddellijk is.

Ten slotte zijn laserablaties ontwikkeld en op grote schaal gebruikt in de afgelopen 15 jaar6,7,8,9,10,11,12. Een laserstraal wordt gericht op de beoogde cel/weefsel. Het induceert zijn ablatie door verhitting, fotoablatie of plasma-geïnduceerde ablatie; het betrokken proces is afhankelijk van de vermogensdichtheid en ^{belichtingstijd13}. De meeste ablatieprotocollen gebruiken UV-lasers voor hun hoge energie. UV-licht wordt echter zowel geabsorbeerd als verstrooid door biologische weefsels. Het richten op diepe cellen vereist dus een hoog laservermogen, dat vervolgens schade veroorzaakt in meer oppervlakkige, buiten het vlak gelegen weefsels. Dit beperkt het gebruik van UV-lasers tot oppervlakkige structuren en verklaart hun relatief lage axiale resolutie. Niet-lineaire optica (zogenaamde twee-fotonenmicroscopie) maakt gebruik van niet-lineaire eigenschappen van licht om een fluorofoor te prikkelen met twee fotonen van ongeveer halve energie in het infrarode domein. Wanneer toegepast op ablaties, heeft dit drie belangrijke voordelen. Ten eerste wordt het infraroodlicht minder verstrooid en minder geabsorbeerd dan UV-licht door biologische ^weefsels14, waardoor diepere structuren kunnen worden bereikt zonder het vereiste laservermogen te vergroten. Ten tweede zorgt het gebruik van een femtoseconde gepulseerde laser voor zeer hoge vermogensdichtheden, waardoor een ablatie ontstaat door plasma-inductie, die, in tegenstelling tot verwarming, niet ruimtelijk ^{diffundeert15}. Ten derde wordt de vermogensdichtheid die plasmavorming induceert alleen op het brandpunt bereikt. Dankzij deze eigenschappen kunnen laserablaties met twee fotonen worden gebruikt om diepe cellen nauwkeurig te richten zonder de omliggende weefselomgeving te beïnvloeden.

Collectieve migraties zijn een uitstekend voorbeeld van ontwikkelingsprocessen waarbij cel-cel interacties fundamenteel zijn. Collectieve migraties worden gedefinieerd als celmigraties waarbij naburige cellen het gedrag van één cel ^{beïnvloeden16}. De aard van deze interacties (chemisch of mechanisch) en hoe ze celmigratie beïnvloeden, kan sterk variëren en wordt vaak niet helemaal begrepen. Het vermogen om cellen te verwijderen en te observeren hoe dit de anderen beïnvloedt, is van cruciaal belang bij het verder ontrafelen van deze collectieve processen. Een paar jaar geleden stelden we vast – met behulp van chirurgische benaderingen – dat de migratie van de polster tijdens zebravisgastrulatie een collectieve migratie ^is17. De polster is een groep cellen die de eerste internaliserende cellen aan de dorsale kant van het embryo ^vormt18. Deze cellen, gelabeld in groen in de Tg (gsc: GFP) transgene lijn, bevinden zich diep in het embryo, onder verschillende lagen epiblastcellen. Tijdens gastrulatie leidt deze groep de uitbreiding van het axiale mesoderm, migrerend van de embryonale organizer naar de dierlijke pool19,20,21,22,23 (figuur 1A). We stelden vast dat cellen contact met hun buren nodig hebben om hun migratie in de richting van de dierenpool te oriënteren. Een beter begrip van de cellulaire en moleculaire bases van deze collectieve migratie houdt echter in dat sommige cellen worden verwijderd om te zien hoe dit de resterende cellen beïnvloedt. Daarom ontwikkelden we ablaties van grote en diepe volumes met behulp van een microscopie-opstelling met twee fotonen. Hier demonstreren we het gebruik van dit protocol om de polster in het midden te scheiden en de gevolgen voor celmigratie te observeren door kernen te volgen die zijn gelabeld met Histone2B-mCherry.