Tiefe und räumlich kontrollierte Volumenablationen mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in der Zebrafisch-Gastrula

Zell-Zell-Interaktionen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung. Zellen liefern Signale, die ihre direkten Nachbarn oder weiter entfernte Zellen wahrnehmen können, wodurch ihr Schicksal und/oder Verhalten beeinflusst wird. Viele dieser Signale sind chemischer Natur. Zum Beispiel produziert eine Zellgruppe in den gut charakterisierten Induktionsereignissen diffusible Moleküle, die das Schicksal einer anderen Zellpopulation ^{beeinflussen1}. Andere Signale sind jedoch mechanisch; Zellen üben Kräfte und Einschränkungen auf ihre Nachbarn aus, die die Nachbarn wahrnehmen und auf die sie ^reagieren2.

Eine Möglichkeit, die Bedeutung dieser Zell-Zell-Interaktionen in vivo zu untersuchen, besteht darin, einige Zellen zu eliminieren und die nachfolgende Entwicklung zu beobachten. Leider sind die verfügbaren Techniken zum Entfernen oder Zerstören von Zellen begrenzt. Zellen können chirurgisch3,4 mit Nadeln oder kleinen Drähten entfernt werden, aber solche Behandlungen sind invasiv, nicht sehr präzise und werden normalerweise unter einem Stereomikroskop durchgeführt, wodurch eine sofortige Bildgebung unter einem Mikroskop verhindert wird. Darüber hinaus bedeutet das Targeting tiefer Zellen, ein Loch in darüber liegendes Gewebe zu stechen, wodurch unerwünschte Störungen entstehen. Genetisch kodierte Photosensibilisatoren wie KillerRed wurden verwendet, um den Zelltod durch Lichtbeleuchtung zu induzieren5. Photosensibilisatoren sind Chromophore, die bei Lichteinstrahlung reaktive Sauerstoffspezies erzeugen. Ihre Haupteinschränkung besteht darin, dass sie lange Lichtbeleuchtungen (etwa 15 Minuten) erfordern, die schwierig zu erreichen sind, wenn sich Zellen bewegen, und dass sie den Zelltod durch Apoptose induzieren, was nicht sofort der Fall ist.

Schließlich wurden Laserablationen entwickelt und in den letzten 15 Jahren weit verbreitet6,7,8,9,10,11,12. Ein Laserstrahl wird auf die Zielzelle/das Zielgewebe fokussiert. Es induziert seine Ablation durch Erhitzen, Photoablation oder plasmainduzierte Ablation; der involvierte Prozess hängt von der Leistungsdichte und der Belichtungszeit ^ab13. Die meisten Ablationsprotokolle verwenden UV-Laser für ihre hohe Energie. UV-Licht wird jedoch von biologischem Gewebe sowohl absorbiert als auch gestreut. Daher erfordert das Targeting tiefer Zellen eine hohe Laserleistung, die dann Schäden in oberflächlicheren Geweben außerhalb der Ebene induziert. Dies beschränkt den Einsatz von UV-Lasern auf oberflächliche Strukturen und erklärt ihre relativ geringe axiale Auflösung. Die nichtlineare Optik (sogenannte Zwei-Photonen-Mikroskopie) nutzt nichtlineare Eigenschaften des Lichts, um ein Fluorophor mit zwei Photonen von etwa halber Energie im Infrarotbereich anzuregen. Bei der Anwendung auf Ablationen hat dies drei Hauptvorteile. Erstens wird das Infrarotlicht weniger gestreut und weniger als UV-Licht von biologischen ^Geweben14 absorbiert, so dass tiefere Strukturen erreicht werden können, ohne die erforderliche Laserleistung zu erhöhen. Zweitens sorgt die Verwendung eines gepulsten Femtosekundenlasers für sehr hohe Leistungsdichten, wodurch eine Ablation durch Plasmainduktion entsteht, die im Gegensatz zur Erwärmung räumlich nicht ^{diffundiert15}. Drittens wird die Leistungsdichte, die die Plasmabildung induziert, nur am Brennpunkt erreicht. Dank dieser Eigenschaften können Zwei-Photonen-Laserablationen verwendet werden, um tiefe Zellen präzise anzugreifen, ohne die umgebende Gewebeumgebung zu beeinträchtigen.

Kollektive Migrationen sind ein hervorragendes Beispiel für Entwicklungsprozesse, bei denen Zell-Zell-Interaktionen grundlegend sind. Kollektive Migrationen sind definiert als Zellmigrationen, bei denen benachbarte Zellen das Verhalten einer Zelle ^{beeinflussen16}. Die Art dieser Wechselwirkungen (chemisch oder mechanisch) und wie sie die Zellmigration beeinflussen, kann stark variieren und ist oft nicht vollständig verstanden. Die Fähigkeit, Zellen zu entfernen und zu beobachten, wie sich dies auf die anderen auswirkt, ist entscheidend für die weitere Entschlüsselung dieser kollektiven Prozesse. Vor einigen Jahren haben wir – mit chirurgischen Ansätzen – festgestellt, dass die Migration der Polster während der Zebrafischgastrulation eine kollektive Migration ^ist17. Die Polster ist eine Gruppe von Zellen, die die ersten internalisierenden Zellen auf der dorsalen Seite des Embryos ^bildet18. Diese Zellen, die in der transgenen Linie Tg(gsc:GFP) grün markiert sind, befinden sich tief im Embryo, unter mehreren Schichten von Epiblastenzellen. Während der Gastrulation führt diese Gruppe die Ausdehnung des axialen Mesoderms an und wandert vom embryonalen Organizer zum Tierischen Pol19,20,21,22,23 (Abbildung 1A). Wir haben festgestellt, dass Zellen Kontakt zu ihren Nachbarn benötigen, um ihre Migration in Richtung des Tierpols auszurichten. Um die zellulären und molekularen Grundlagen dieser kollektiven Migration besser zu verstehen, müssen jedoch einige Zellen entfernt werden, um zu sehen, wie sich dies auf die verbleibenden auswirkt. Wir haben daher Ablationen von großen und tiefen Volumina mit einem Zwei-Photonen-Mikroskopie-Setup entwickelt. Hier demonstrieren wir die Verwendung dieses Protokolls, um die Polster in ihrer Mitte zu durchtrennen und die Folgen für die Zellmigration zu beobachten, indem wir mit Histone2B-mCherry markierte Kerne verfolgen.