אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה
Summary
התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.
Abstract
מורפוגנזה כרוכה בתנועות תאים רבות כדי לארגן תאים לתוך רקמות ואיברים. לפיתוח תקין, כל התנועות האלה צריכות להיות מתואמות היטב, וצבירת ראיות מצביעה על כך שזה מושג, לפחות בחלקו, באמצעות אינטראקציות מכניות. בדיקת זה בעובר דורשת בעיות פיזיות ישירות. אבלציות לייזר הן אפשרות בשימוש הולך וגדל המאפשרת להקל על אילוצים מכניים או בידוד פיזי של שתי אוכלוסיות תאים זו מזו. עם זאת, אבלציות רבות מבוצעות עם לייזר אולטרה סגול (UV), המציע רזולוציה צירית מוגבלת וחדירת רקמות. שיטה מתוארת כאן כדי לנפח נפחים עמוקים, משמעותיים ומוגדרים היטב באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. אבלציות מודגמות בקו דגי זברה מהונדס המבטא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק במסנדונדורם צירי ומשמשות לניתוק המסנדודרם צירי מבלי להשפיע על הקטודרם המשתרע יתר על המידה או על תא החלמון הבסיסי. התנהגות התא מנוטרת על-ידי הדמיה חיה לפני ואחרי אבלציה. פרוטוקול אבלציה יכול לשמש בשלבים התפתחותיים שונים, על כל סוג תא או רקמה, בקשקשים הנעים בין כמה מיקרונים ליותר ממאה מיקרון.
Introduction
אינטראקציות בין תאים ממלאות תפקידים חיוניים בהתפתחות. תאים מספקים אותות לכך שהשכנים הישירים שלהם, או התאים רחוקים יותר, יכולים לתפוס, ובכך להשפיע על גורלם ו /או התנהגותם. רבים מהאותות האלה הם כימיים בטבע. לדוגמה, באירועי אינדוקציה מאופיינים היטב, קבוצת תאים אחת מייצרת מולקולות מפוזרות המשפיעות על גורלה של אוכלוסיית תאים אחרת1. אותות אחרים, לעומת זאת, הם מכניים; תאים מפעילים כוחות ואילוצים על שכניהם, שהשכנים תופסים ומגיבים ל2.
דרך אחת ללמוד את החשיבות של אינטראקציות תא-תאים אלה ב vivo היא לחסל כמה תאים ולבחון את ההתפתחות הבאה. למרבה הצער, הטכניקות הזמינות כדי להסיר או להרוס תאים מוגבלים. תאים ניתן להסיר בניתוח3,4, באמצעות מחטים או חוטים קטנים, אבל טיפולים כאלה הם פולשניים, לא מדויקים מאוד, ובדרך כלל מבוצעים תחת סטריאוטיקרוסקופ, מניעת הדמיה מיידית תחת מיקרוסקופ. יתר על כן, מיקוד תאים עמוקים מרמז פירסינג חור ברקמות overlying, יצירת מוטרדים לא רצויים. רגישים לאור מקודדים גנטית, כגון KillerRed, שימשו כדי לגרום למוות תאים באמצעות תאורת אור5. רגישים לאור הם כרומופורים המייצרים מינים של חמצן תגובתי על הקרנת אור. המגבלה העיקרית שלהם היא שהם דורשים תאורת אור ארוכה (סביב 15 דקות), אשר עשוי להיות קשה להשיג אם תאים נעים, וכי הם לגרום למוות תאים באמצעות אפופטוזיס, אשר אינו מיידי.
לבסוף, אבלציות לייזר פותחו בשימוש נרחב ב -15 השנים האחרונות6,7,8,9,10,11,12. קרן לייזר מתמקדת בתא/רקמה הממוקדים. זה גורמת אבלציה שלה באמצעות חימום, photoablation, או אבלציה הנגרמת על ידי פלזמה; התהליך המעורב תלוי בצפיפות הכוח וזמן החשיפה13. רוב פרוטוקולי אבלציה להשתמש לייזרי UV עבור האנרגיה הגבוהה שלהם. עם זאת, אור UV נספג ומפוזר על ידי רקמות ביולוגיות. לכן, מיקוד תאים עמוקים דורש כוח לייזר גבוה, אשר לאחר מכן גורמת נזקים ברקמות שטחיות יותר, מחוץ למטוס. זה מגביל את השימוש בלייזר UV למבנים שטחיים ומסביר את הרזולוציה האקסית הנמוכה יחסית שלהם. אופטיקה לא ליניארית (מה שנקרא מיקרוסקופיה דו-פוטונית) משתמשת במאפיינים לא ליניאריים של אור כדי לרגש פלואורופור עם שני פוטונים של כחצי אנרגיה בתחום האינפרא אדום. כאשר מוחל על אבלציות, יש לזה שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, אור האינפרא אדום מפוזר פחות ונספג פחות מאור UV על ידי רקמות ביולוגיות14, ומאפשר להגיע למבנים עמוקים יותר מבלי להגדיל את כוח הלייזר הנדרש. שנית, השימוש בלייזר פעום פמטו-שניות מספק צפיפות הספק גבוהה מאוד, ויוצר אבלציה באמצעות אינדוקציה של פלזמה, אשר, בניגוד לחימום, אינו מתפזר מרחבי15. שלישית, צפיפות הכוח הגורמת להיווצרות פלזמה מגיעה בנקודת המוקד בלבד. הודות למאפיינים אלה, ניתן להשתמש בבלציות לייזר של שני פוטונים כדי למקד במדויק תאים עמוקים מבלי להשפיע על סביבת הרקמה שמסביב.
הגירות קולקטיביות הן דוגמה מצוינת לתהליכים התפתחותיים שבהם אינטראקציות בין תאים הן בסיסיות. העברות קולקטיביות מוגדרות כהעברות תאים שבהן תאים שכנים משפיעים על אופן הפעולה של תא אחד16. אופי האינטראקציות הללו (כימיות או מכניות) וכיצד הן משפיעות על נדידת תאים יכולים להשתנות מאוד ולעתים קרובות אינו מובן לחלוטין. היכולת להסיר תאים ולבחון כיצד זה משפיע על האחרים היא קריטית בפענוח נוסף של תהליכים קיבוציים אלה. לפני מספר שנים קבענו — באמצעות גישות כירורגיות — שהנדידה של הפוסטר במהלך בגרות דגי הזברה היא נדידה קולקטיבית17. הפולסטר הוא קבוצה של תאים המהווה את התאים ההפנמה הראשונה בצד העור של העובר18. תאים אלה, המסומנים בירוק בקו הטרנסגני Tg(gsc:GFP), ממוקמים עמוק בעובר, מתחת למספר שכבות של תאי אפיבלסט. במהלך ההסתעפות, קבוצה זו מובילה את הרחבת המסודרמה צירית, נודדת מהמארגן העוברי לקוטב החייתי19,20,21,22,23 (איור 1A). קבענו שתאים דורשים מגע עם שכניהם כדי לכוון את נדידתם לכיוון עמוד החיה. עם זאת, הבנה טובה יותר של הבסיסים התאיים והמולקולריים של הגירה קולקטיבית זו כרוכה בהסרת תאים מסוימים כדי לראות כיצד זה משפיע על הנותרים. לכן פיתחנו אבלציות של נפחים גדולים ועמוקים באמצעות מערך מיקרוסקופיה של שני פוטונים. כאן, אנו מדגימים את השימוש בפרוטוקול זה כדי לנתק את הפולסטר באמצעו ולבחון את ההשלכות על נדידת תאים על ידי מעקב אחר גרעינים המסומנים עם Histone2B-mCherry.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש באופטיקה לא ליניארית כדי לבצע אבלציות נפח עמוקות ומוגדרות היטב. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא למצוא תנאי טיפול המספקים מספיק אנרגיה כדי לאפשר אבלציות, אבל לא יותר מדי אנרגיה, כדי למנוע פסולת מוגזמת או cavitation. כמות האנרגיה המועברת באתר היעד תלויה בעיקר ב:…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאמילי מננט על טיפול בדגים, למתקן הביו-הדמיה הפוליטכני, ובמיוחד לפייר מהו, על הסיוע בהדמיה חיה על הציוד שלהם שנתמך בחלקו על ידי Région Ile-de-France (ביניים) ו- Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 צרפת BioImaging). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי ANR 15-CE13-0016-1, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016, ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם המענק מארי Skłodowska-Curie No 840201, המיניסטר דה ל’אנסנסיגנציה Supérieur et de la Recherche והמרכז הלאומי דה לה רשצ’ה סיאנטיפיק.
Materials
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
- Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., Röper, J. -. C., Farge, E. Mechanotransduction’s impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition – Four Volume Set. , (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B. Migrations cellulaires collectives. Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. . Foundations of Experimental Embryology. , (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
