ゼブラフィッシュガストラの2光子顕微鏡を用いた深部および空間制御体積アブレーション

細胞間相互作用は、開発において重要な役割を果たします。細胞は、直接の隣人、または遠く離れた細胞が知覚できる信号を提供し、それによってその運命および/または行動に影響を与えます。これらの信号の多くは、自然の中で化学的です。例えば、よく特徴付けられる誘導事象では、ある細胞群は、別の細胞集団の運命に影響を与える拡散性分子^{を生成する1}。しかし、他の信号は機械的です。細胞は、隣人が知覚し、²に応答する彼らの隣人に力と制約を発揮します。

生体内での細胞間相互作用の重要性を研究する一つの方法は、細胞を除去し、その後の発達を観察することです。残念ながら、細胞を除去または破壊する利用可能な技術は限られています。細胞は、針または小さなワイヤーを使用して外科的^に3,4を除去することができるが、そのような治療は侵襲的であり、あまり正確ではなく、通常は実体顕微鏡下で行われ、顕微鏡下での即時のイメージングを防ぐ。さらに、深部細胞を標的とすることは、上層部の組織に穴を開け、望ましくない摂動を生み出すことも意味します。遺伝的にコード化された光化物は、KillerRedのような、光照明を介して細胞死を誘導するために使用されてきた⁵。光化剤は、光照射時に活性酸素種を生成するクロモフォアです。彼らの主な制限は、細胞が動いている場合に達成するのが難しいかもしれない長い光のイルミネーション(約15分)を必要とし、即座ではないアポトーシスを通じて細胞死を誘発することです。

最後に、レーザーアブレーションは、過去15年間で開発され、広く使用されています ^{6,7,8,9,10,11,12}.レーザービームは標的細胞/組織に焦点を合わせる。それは加熱、光切除、またはプラズマ誘発アブレーションを通してそのアブレーションを誘発する;関係するプロセスは、電力密度と露光時間¹³に依存します。ほとんどのアブレーションプロトコルは、高エネルギーにUVレーザーを使用します。しかし、UV光は両方とも生体組織によって吸収され、散乱される。したがって、深部細胞を標的化するには高いレーザーパワーが必要であり、その後、より表面的で平面外の組織に損傷を与える。これは、表面構造にUVレーザーの使用を制限し、その比較的低い軸解像度を説明します。非線形光学(いわゆる2光子顕微鏡)は、非線形の光特性を使用して、赤外線領域内の約半エネルギーの2つの光子を有する蛍光色素を励起する。アブレーションに適用する場合、これには3つの主な利点があります。まず、赤外線は生体組織¹⁴によるUV光よりも散乱が少なく、吸収が少なく、必要なレーザーパワーを増加させることなく、より深い構造に到達することを可能にする。第二に、フェムト秒パルスレーザーの使用は、プラズマ誘導を介してアブレーションを作成し、加熱に反して、空間的に拡散しない非常に高い電力密度を提供します¹⁵。第3に、プラズマ形成を誘導する電力密度は、焦点のみで到達する。これらの特性のおかげで、2光子レーザーアブレーションは、周囲の組織環境に影響を与えることなく、深部細胞を正確に標的化するために使用することができます。

集団移動は、細胞と細胞の相互作用が基本的な発達過程の優れた例である。集合的な移行は、隣接するセルが 1 つの ^cell16 の動作に影響を与えるセル移動として定義されます。これらの相互作用の性質(化学的または機械的)およびそれらが細胞の移動に与える影響は大きく異なり、多くの場合、完全には理解されていません。細胞を除去し、これが他の人にどのような影響を与えるかを観察する能力は、これらの集合的なプロセスをさらに解明する上で重要です。数年前、ゼブラフィッシュの胃の中でポルスターの移動が集団移住であることを、外科的アプローチを用いて確立^{しました17}。ポルスターは、胚¹⁸の後側の第1の内在化細胞を構成する細胞群である。 Tg(gsc:GFP) トランスジェニックラインで緑色に標識されたこれらの細胞は、胚の深部、エピブラスト細胞のいくつかの層の下に位置する。胃の間、このグループは軸性中胚の延長を導き、胚の形成者から動物の極^{19、20、21、22、23} に移動する(図1A)。私たちは、細胞が動物の極の方向に彼らの移動を向けるために彼らの隣人との接触を必要とすることを確立しました。しかし、この集団移動の細胞および分子塩基をよりよく理解するには、いくつかの細胞を除去して、これが残りの細胞にどのような影響を与えるかを確認する必要があります。そこで、2光子顕微鏡を用いて大体積と深いボリュームのアブレーションを開発しました。ここでは、このプロトコルを使用して、その真ん中にポルスターを切断し、Histone2B-mCherryで標識された核を追跡することによって細胞移動の結果を観察することを実証する。