Zebrafish Gastrula'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Derin ve Mekansal Kontrollü Hacim Ablasyonları
Summary
Embriyonik gelişim, hücre hareketinin büyük ölçekli koordinasyonunu gerektirir. İki fotonlu ekscitasyon aracılı lazer ablasyon, büyük derin hücre gruplarının mekansal olarak kontrol edilen 3 boyutlu ablasyonunu sağlar. Ek olarak, bu teknik , in vivo olarak toplu olarak göç eden hücrelerin mekanik ortamlarındaki pertürbasyonlara reaksiyonlarını araştırabilir.
Abstract
Morfogenez, hücreleri dokulara ve organlara düzenlemek için birçok hücre hareketini içerir. Doğru gelişim için, tüm bu hareketlerin sıkı bir şekilde koordine edilmesi gerekir ve kanıtların birikmesi, bunun en azından kısmen mekanik etkileşimlerle başarılmasını göstermektedir. Bunu embriyoda test etmek doğrudan fiziksel pertürbasyon gerektirir. Lazer ablasyonlar, mekanik kısıtlamaların giderilmesine veya iki hücre popülasyonunun fiziksel olarak birbirinden izole edilmesine izin veren giderek daha fazla kullanılan bir seçenektir. Bununla birlikte, birçok ablasyon, sınırlı eksenel çözünürlük ve doku penetrasyonu sunan ultraviyole (UV) lazer ile gerçekleştirilir. Burada iki fotonlu mikroskop kullanarak derin, önemli ve mekansal olarak iyi tanımlanmış hacimleri alevlendirmek için bir yöntem açıklanmıştır. Ablasyonlar, eksenel mezendodermdeki yeşil floresan proteini ifade eden transgenik bir zebra balığı hattında gösterilir ve ektodermi veya alttaki yumurta sarısı hücresini etkilemeden eksenel mezendodermi kesmek için kullanılır. Hücre davranışı ablasyon öncesi ve sonrası canlı görüntüleme ile izlenir. Ablasyon protokolü farklı gelişim aşamalarında, herhangi bir hücre tipinde veya dokuda, birkaç mikrondan yüzden fazla mikrona kadar değişen ölçeklerde kullanılabilir.
Introduction
Hücre-hücre etkileşimleri gelişimde hayati roller oynar. Hücreler, doğrudan komşularının veya daha uzaktaki hücrelerin algılayabildiği sinyaller sağlar, böylece kaderlerini ve/ veya davranışlarını etkileri. Bu sinyallerin çoğu doğada kimyasaldır. Örneğin, iyi karakterize indüksiyon olaylarında, bir hücre grubu başka bir hücre popülasyonunun kaderini etkileyen difüzör moleküller üretir1. Bununla birlikte, diğer sinyaller mekaniktir; hücreler, komşuların algıladığı ve yanıt verdiği komşuları üzerinde kuvvetler ve kısıtlamalar uygular2.
Bu hücre-hücre etkileşimlerinin vivodaki önemini incelemenin bir yolu, bazı hücreleri ortadan kaldırmak ve sonraki gelişimi gözlemlemektir. Ne yazık ki, hücreleri çıkarmak veya yok etmek için mevcut teknikler sınırlıdır. Hücreler cerrahi olarak 3,4, iğneler veya küçük teller kullanılarak çıkarılabilir, ancak bu tür tedaviler invazivdir, çok kesin değildir ve genellikle bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir ve mikroskop altında anında görüntülemeyi önler. Ayrıca, derin hücreleri hedeflemek, aşırı dokularda bir delik açmak ve istenmeyen pertürbasyonlar oluşturmak anlamına gelir. KillerRed gibi genetik olarak kodlanmış ışığa duyarlılıklar, ışık aydınlatması yoluyla hücre ölümünü teşvik etmek için kullanılmıştır5. Işığa duyarlılıklar, ışık ışınlama üzerine reaktif oksijen türleri üreten kromoforlardır. Ana sınırlamaları, hücreler hareket ediyorsa elde edilmesi zor olabilecek uzun ışık aydınlatmaları (yaklaşık 15 dk) gerektirmeleri ve acil olmayan apoptoz yoluyla hücre ölümünü teşvik etmeleridir.
Son olarak, lazer ablasyonları son 15 yılda geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmaktadır6,7,8,9,10,11,12. Lazer ışını hedeflenen hücre/dokuya odaklanır. Isıtma, fotoablasyon veya plazma kaynaklı ablasyon yoluyla ablasyonunu tetikler; ilgili süreç güç yoğunluğuna ve pozlama süresine bağlıdır13. Çoğu ablasyon protokolü yüksek enerjileri için UV lazerleri kullanır. Bununla birlikte, UV ışığı biyolojik dokular tarafından hem emilir hem de dağılır. Bu nedenle, derin hücreleri hedeflemek yüksek bir lazer gücü gerektirir, bu da daha yüzeysel, düzlem dışı dokularda hasarlara neden olandır. Bu, UV lazerlerin kullanımını yüzeysel yapılarla sınırlar ve nispeten düşük eksenel çözünürlüklerini açıklar. Doğrusal olmayan optikler (iki foton mikroskopisi olarak adlandırılır), kızılötesi etki alanında yaklaşık yarım enerjili iki foton ile bir floroforu heyecanlandırmak için ışığın doğrusal olmayan özelliklerini kullanır. Ablasyonlara uygulandığında, bunun üç ana avantajı vardır. İlk olarak, kızılötesi ışık biyolojik dokular tarafından UV ışığından daha az dağınık ve daha az emilir14, gerekli lazer gücünü artırmadan daha derin yapılara ulaşmayı sağlar. İkincisi, femtosaniye darbeli lazer kullanımı çok yüksek güç yoğunlukları sağlar, plazma indüksiyonu yoluyla bir ablasyon oluşturur, bu da ısıtmanın aksine, mekansal olarak yayılmaz15. Üçüncü olarak, plazma oluşumunu indükleyen güç yoğunluğuna sadece odak noktasında ulaşılır. Bu özellikleri sayesinde iki fotonlu lazer ablasyonlar, çevredeki doku ortamını etkilemeden derin hücreleri hassas bir şekilde hedeflemek için kullanılabilir.
Kolektif göçler, hücre-hücre etkileşimlerinin temel olduğu gelişimsel süreçlerin mükemmel bir örneğidir. Toplu geçişler, komşu hücrelerin bir hücrenin davranışını etkilediği hücre geçişleri olarak tanımlanır16. Bu etkileşimlerin doğası (kimyasal veya mekanik) ve hücre göçini nasıl etkilediği büyük ölçüde değişebilir ve çoğu zaman tam olarak anlaşılamamıştır. Hücreleri çıkarma ve bunun diğerlerini nasıl etkilediğini gözlemleme yeteneği, bu kolektif süreçlerin daha da çözülmesinde kritik öneme sahiptir. Birkaç yıl önce, cerrahi yaklaşımlar kullanarak, zebra balığı gastrülasyonu sırasında polster göçünün kolektif bir göç olduğunu belirledik17. Polster, embriyonun dorsal tarafındaki ilk içselleştirici hücreleri oluşturan bir hücre grubudur18. Tg(gsc:GFP) transgenik çizgisinde yeşil etiketli bu hücreler embriyonun derinliklerinde, epiblast hücrelerinin birkaç katmanının altında bulunur. Gastrülasyon sırasında bu grup eksenel mezoderm’in uzantısına öncülük eder ve embriyonik organizatörden hayvan kutbuna göç eder19,20,21,22,23 (Şekil 1A). Hücrelerin göçlerini hayvan kutbu yönünde yönlendirmek için komşularıyla temasa ihtiyaç duyduklarına dair tespit ettik. Bununla birlikte, bu kolektif göçün hücresel ve moleküler temellerini daha iyi anlamak, bunun kalanları nasıl etkilediğini görmek için bazı hücrelerin çıkarılmasını içerir. Bu nedenle, iki fotonlu bir mikroskopi kurulumu kullanarak büyük ve derin hacimlerde ablasyonlar geliştirdik. Burada, histone2B-mCherry ile etiketlenmiş çekirdekleri izleyerek bu protokolün ortasındaki polster’ı kesmek ve hücre göçü üzerindeki sonuçlarını gözlemlemek için kullanıldığını gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, derin ve mekansal olarak iyi tanımlanmış hacim ablasyonları gerçekleştirmek için doğrusal olmayan optikler kullanan bir protokol açıklıyoruz. Protokolün en kritik adımı, aşırı döküntü veya kavitasyondan kaçınmak için ablasyonlara izin vermek için yeterli enerji sağlayan, ancak çok fazla enerji vermeyen tedavi koşulları bulmaktır. Hedef sahadaki enerji miktarı esas olarak şunları bağlıdır: (1) lazer çıkış gücü, (2) lazer hizalama kalitesi, (3) ablasyon düzlemine ulaşmak i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Emilie Menant’a balık bakımı için, Polytechnique Biyogörüntüleme Tesisi’ne, özellikle Pierre Mahou’ya, kısmen Région Ile-de-France (interDIM) ve Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2, ANR-10-INBS-04 France BioImaging) tarafından desteklenen ekipmanlarında canlı görüntüleme konusunda yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma ANR hibeleri 15-CE13-0016-1 tarafından desteklenmiştir, 18-CE13-0024, 20-CE13-0016 ve Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması no 840201 kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı, Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ve Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
- Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., Röper, J. -. C., Farge, E. Mechanotransduction’s impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition – Four Volume Set. , (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B. Migrations cellulaires collectives. Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. . Foundations of Experimental Embryology. , (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
