عمليات الاستئصال العميقة والتحكم المكانية في الحجم باستخدام مجهر فوتونين في زيبرافيش غاسترولا
Summary
يتطلب التطور الجنيني تنسيقا واسع النطاق لحركة الخلية. يسمح الإثارة ثنائية الفوتونيز بالاجتثاث بالليزر بوساطة الاستئصال ثلاثي الأبعاد الذي يتم التحكم فيه مكانيا لمجموعات كبيرة من الخلايا العميقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية التحقيق في رد فعل الخلايا المهاجرة بشكل جماعي في الجسم الحي للاضطرابات في بيئتها الميكانيكية.
Abstract
مورفوجينيسيس ينطوي على العديد من حركات الخلايا لتنظيم الخلايا في الأنسجة والأعضاء. ومن أجل التنمية السليمة، يجب تنسيق جميع هذه الحركات بإحكام، وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن ذلك يتحقق، على الأقل جزئيا، من خلال التفاعلات الميكانيكية. اختبار هذا في الجنين يتطلب الاضطرابات الجسدية المباشرة. الاستئصال بالليزر هي خيار يستخدم بشكل متزايد الذي يسمح بتخفيف القيود الميكانيكية أو عزل جسديا اثنين من مجموعات الخلايا من بعضها البعض. ومع ذلك ، يتم إجراء العديد من عمليات الاستئصال باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية (UV) ، والذي يوفر دقة محورية محدودة واختراق الأنسجة. يتم وصف طريقة هنا ل ablate عميقة، كبيرة، وأحجام محددة بشكل جيد مكانيا باستخدام المجهر اثنين الفوتون. يتم عرض الاستئصالات في خط حمار وحشي معدل وراثيا يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر في mesendoderm المحوري ويستخدم لقطع mesendoderm المحوري دون التأثير على ectoderm المفرط أو خلية الصفار الأساسية. يتم مراقبة سلوك الخلية عن طريق التصوير الحي قبل وبعد الاستئصال. يمكن استخدام بروتوكول الاستئصال في مراحل نمو مختلفة، على أي نوع من الخلايا أو الأنسجة، على نطاقات تتراوح بين بضعة ميكرونات إلى أكثر من مائة ميكرون.
Introduction
تلعب التفاعلات بين الخلية والخلية أدوارا حيوية في التنمية. توفر الخلايا إشارات يمكن لجيرانها المباشرين، أو الخلايا البعيدة، إدراكها، وبالتالي التأثير على مصيرهم و/أو سلوكهم. العديد من هذه الإشارات هي كيميائية في طبيعتها. على سبيل المثال، في أحداث التعريفية ذات الخصائص الجيدة، تنتج مجموعة خلايا واحدة جزيئات قابلة للنشر تؤثر على مصير مجموعة خلايا أخرى1. غير أن الإشارات الأخرى ميكانيكية؛ الخلايا تمارس القوات والقيود على جيرانهم، والتي يرى الجيران والرد على2.
إحدى الطرق لدراسة أهمية هذه التفاعلات بين الخلية والخلية في الجسم الحي هي القضاء على بعض الخلايا ومراقبة التطور اللاحق. لسوء الحظ، التقنيات المتاحة لإزالة أو تدمير الخلايا محدودة. يمكن إزالة الخلايا جراحيا3,4، باستخدام الإبر أو الأسلاك الصغيرة، ولكن هذه العلاجات الغازية، ليست دقيقة جدا، وعادة ما يتم تنفيذها تحت منظار مجسم، ومنع التصوير الفوري تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، فإن استهداف الخلايا العميقة يعني ثقب ثقب في الأنسجة المفرطة، وخلق الاضطرابات غير المرغوب فيها. وقد استخدمت الحساسات الضوئية المشفرة وراثيا، مثل KillerRed، للحث على موت الخلايا عن طريق الإضاءة الخفيفة5. الحساسات الضوئية هي الكروموفوريس التي تولد أنواع الأكسجين التفاعلية عند تشعيع الضوء. الحد الرئيسي هو أنها تتطلب إضاءات ضوئية طويلة (حوالي 15 دقيقة) ، والتي قد يكون من الصعب تحقيقها إذا كانت الخلايا تتحرك ، وأنها تحفز موت الخلايا من خلال موت الخلايا المبرمج ، وهو أمر غير فوري.
وأخيرا، تم تطوير عمليات الاستئصال بالليزر واستخدامها على نطاق واسع في السنوات ال 15 الماضية6,7,8,9,10,11,12. ويركز شعاع الليزر على الخلية المستهدفة / الأنسجة. فإنه يحفز الاستئصال من خلال التدفئة, الاجتثاث الضوئي, أو الاستئصال الناجم عن البلازما; تعتمد العملية المعنية على كثافة الطاقة ووقت التعرض13. معظم بروتوكولات الاستئصال استخدام أشعة الليزر للأشعة فوق البنفسجية لطاقتها العالية. ومع ذلك، يتم امتصاص ضوء الأشعة فوق البنفسجية على حد سواء وتناثرها من قبل الأنسجة البيولوجية. وبالتالي ، فإن استهداف الخلايا العميقة يتطلب طاقة ليزر عالية ، مما يؤدي بعد ذلك إلى أضرار في أنسجة أكثر سطحية وخارج الطائرة. وهذا يحد من استخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية إلى هياكل سطحية ويفسر دقة المحورية منخفضة نسبيا. البصريات غير الخطية (ما يسمى المجهر اثنين فوتون) يستخدم خصائص غير خطية للضوء لإثارة الفلوروفور مع اثنين من فوتونات من نصف الطاقة تقريبا في مجال الأشعة تحت الحمراء. عند تطبيقها على الاستئصال ، وهذا له ثلاث مزايا رئيسية. أولا، ضوء الأشعة تحت الحمراء أقل تشتتا وأقل امتصاصا من الأشعة فوق البنفسجية بواسطة الأنسجة البيولوجية14، مما يسمح بالوصول إلى هياكل أعمق دون زيادة قوة الليزر المطلوبة. ثانيا، استخدام ليزر نبضي femtosecond يوفر كثافات طاقة عالية جدا، وخلق الاستئصال من خلال التعريفي البلازما، والتي، خلافا للتدفئة، لا تنتشر مكانيا15. ثالثا، يتم الوصول إلى كثافة الطاقة التي تحفز تكوين البلازما في نقطة الاتصال فقط. وبفضل هذه الخصائص، يمكن استخدام استئصال الليزر ثنائي الفوتون لاستهداف الخلايا العميقة بدقة دون التأثير على بيئة الأنسجة المحيطة.
الهجرات الجماعية هي مثال ممتاز على العمليات التنموية التي تكون فيها التفاعلات بين الخلية والخلية أساسية. يتم تعريف الهجرات الجماعية على أنها هجرات الخلايا التي تؤثر فيها الخلايا المجاورة على سلوك الخلية الواحدة16. ويمكن أن تختلف طبيعة هذه التفاعلات (الكيميائية أو الميكانيكية) وكيفية تأثيرها على هجرة الخلايا اختلافا كبيرا وغالبا ما لا تكون مفهومة تماما. القدرة على إزالة الخلايا ومراقبة كيفية تأثير ذلك على الآخرين أمر بالغ الأهمية في زيادة كشف هذه العمليات الجماعية. قبل بضع سنوات، أثبتنا – باستخدام النهج الجراحية – أن هجرة البولستر أثناء تخثر سمك الحمار الوحشي هي هجرة جماعية17. بولستر هو مجموعة من الخلايا التي تشكل أول خلايا استيعاب على الجانب الظهري من الجنين18. هذه الخلايا، وصفت باللون الأخضر في خط Tg(gsc:GFP) المعدلة وراثيا، وتقع في عمق الجنين، تحت عدة طبقات من الخلايا epiblast. أثناء الاختراق ، تقود هذه المجموعة تمديد المحور المحوري ، والهجرة من المنظم الجنيني إلى القطب الحيواني19،20،21،22،23 (الشكل 1A). لقد أثبتنا أن الخلايا تتطلب الاتصال مع جيرانها لتوجيه هجرتهم في اتجاه القطب الحيواني. ومع ذلك، فإن فهم الأسس الخلوية والجزيئية لهذه الهجرة الجماعية بشكل أفضل ينطوي على إزالة بعض الخلايا لمعرفة كيف يؤثر ذلك على الخلايا المتبقية. لذلك ، قمنا بتطوير عمليات استئصال من كميات كبيرة وعميقة باستخدام إعداد مجهري ثنائي الفوتون. هنا، نحن نظهر استخدام هذا البروتوكول لقطع بولستر في وسطه ومراقبة العواقب على هجرة الخلايا عن طريق تتبع نواة المسمى مع Histone2B-mCherry.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقوم بوصف بروتوكول يستخدم البصريات غير الخطية لإجراء عمليات استئصال حجم عميقة ومحددة مكانيا. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي العثور على ظروف العلاج التي توفر الطاقة الكافية للسماح بالاجتثاث ، ولكن ليس الكثير من الطاقة ، لتجنب الحطام المفرط أو التجويف. تعتمد كمية الطاقة المسلمة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إيميلي مينانت على رعاية الأسماك، ومرفق التصوير الحيوي للفنون التطبيقية، ولا سيما بيير ماهو، للمساعدة في التصوير الحي على معداتهم بدعم جزئي من ريجيون إيل دو فرانس (interDIM) ووكالة الأنباء الوطنية دي لا ريشرش (ANR-11-EQPX-0029 Morphoscope2، ANR-10-INBS-04 France BioImaging). وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح ANR 15-CE13-0016-1، 18-CE13-0024، 20-CE13-0016، وبرنامج الاتحاد الأوروبي لأفق 2020 للبحث والابتكار بموجب اتفاق منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 840201، ومينيستير دي L’Enseignement Supérieur et de la Recherche والمركز الوطني للبحوث العلمية.
Materials
| 25x water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| Agarose | PanReac AppliChem | A8963,0500 | |
| Data analysis software : Matlab | Math Works | ||
| Electro-optic modulator (EOM) | ConOptics | 350-80LA | |
| Embryo Medium (EM) solution | Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio), 5th Edition. University of Oregon Press, Eugene (Book). (2000). | ||
| Environmental chamber chamber | Okolab | H201-T-UNIT-BL | |
| EOM driver | ConOptics | 302RM | |
| Fluorescence source | Lumencor | SOLA | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | 300085 | Outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm |
| Glass pipettes | Volac | D810 | Tip should be fire polished |
| Green/ablation laser | Spectra Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| Histone2B-mCherry mRNA | Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012) | ||
| Image analysis software: IMARIS | Bitplane | ||
| ImSpector software | Abberior Instruments Development Team | ||
| Injection mold | Adapative Science Tools | I-34 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | |
| Micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140-122 | 10 000 units penicillin and 10 mgstreptomycin per ml |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hammamatsu | H7422-40 | |
| PicoPump (Air injector) | World Precision Instrument | PV820 | |
| Red laser | Spectra Physics | OPO/Insight DeepSee | |
| RNAse free water for injection | Sigma | W3500 | |
| Spreadsheet software: Excel | Microsoft | ||
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | |
| Tg(gsc:GFP) zebrafish line | Doitsidou, M. et al. Guidance of primordial germ cell migration by the chemokine SDF-1. Cell. 111 (5), 647–59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002). | ||
| TriM Scope II microscope | La Vision Biotech |
References
- Slack, J. M. W. Embryonic induction. Mechanisms of Development. 41 (2-3), 91-107 (1993).
- Fernandez-Sanchez, M. -. E., Brunet, T., Röper, J. -. C., Farge, E. Mechanotransduction’s impact on animal development, evolution, and tumorigenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 373-397 (2015).
- Shih, J., Fraser, S. E. Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage. Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).
- Selleck, M. A. J. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 51 (51), 1-21 (1996).
- Bulina, M. E., et al. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotechnology. 24 (1), 95-99 (2006).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).
- Colombelli, J., Grill, S. W., Stelzer, E. H. K. Ultraviolet diffraction limited nanosurgery of live biological tissues. Review of Scientific Instruments. 75 (2), 472-478 (2004).
- Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -. P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1189, 219-235 (2015).
- Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
- Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), (2020).
- Bonnet, I., et al. Mechanical state, material properties and continuous description of an epithelial tissue. Journal of the Royal Society, Interface. 9 (75), 2614-2623 (2012).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468 (7327), 1110-1115 (2010).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering, Second Edition – Four Volume Set. , (2019).
- Smith, A. M., Mancini, M. C., Nie, S. Bioimaging: second window for in vivo imaging. Nature Nanotechnology. 4 (11), 710-711 (2009).
- Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Cortical forces in cell shape changes and tissue morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 95, 93-144 (2011).
- Theveneau, E., David, N. B. Migrations cellulaires collectives. Medecine/Sciences. 30 (8-9), 751-757 (2014).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 16945-16950 (2012).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Montero, J. -. A., Kilian, B., Chan, J., Bayliss, P. E., Heisenberg, C. -. P. Phosphoinositide 3-kinase is required for process outgrowth and cell polarization of gastrulating mesendodermal cells. Current Biology. 13 (15), 1279-1289 (2003).
- Ulrich, F., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Kai, M., Heisenberg, C. -. P., Tada, M. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate individual cell behaviours underlying the directed migration of prechordal plate progenitor cells during zebrafish gastrulation. Development. 135 (18), 3043-3051 (2008).
- Smutny, M., et al. Friction forces position the neural anlage. Nature Cell Biology. 19 (4), 306-317 (2017).
- Johansson, M., Giger, F. A., Fielding, T., Houart, C. Dkk1 controls cell-cell interaction through regulation of non-nuclear β-Catenin pools. Developmental Cell. 51 (6), 775-786 (2019).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Grill, S. W., Howard, J., Schäffer, E., Stelzer, E. H. K., Hyman, A. A. The distribution of active force generators controls mitotic spindle position. Science. 301 (5632), 518-521 (2003).
- Desprat, N., Supatto, W., Pouille, P. -. A. A., Beaurepaire, E., Farge, E. Tissue deformation modulates twist expression to determine anterior midgut differentiation in Drosophila embryos. Developmental Cell. 15 (3), 470-477 (2008).
- Farhadifar, R., Röper, J. -. C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing. Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).
- Willier, B. H., Oppenheimer, J. M. . Foundations of Experimental Embryology. , (1964).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Bosze, B., et al. Pcdh18a regulates endocytosis of E-cadherin during axial mesoderm development in zebrafish. Histochemistry and Cell Biology. 154 (5), 463-480 (2020).
