Somitogenezi Yöneten Sinyal Salınımlarının Fonksiyonel Olarak İncelenmesi İçin Bir Mikroakışkan Yaklaşımı
Summary
Mikroakışkan bir çip üzerinde fare embriyonik dokusunun kültürü ve manipülasyonu için bir protokol sağlanır. Yol modülatörlerinin darbelerini uygulayarak, bu sistem fare somitogenezinin fonksiyonel araştırması için sinyal salınımlarını harici olarak kontrol etmek için kullanılabilir.
Abstract
Gelişmekte olan bir fare embriyosunun presomitik mezoderminin periyodik segmentasyonu, bir sinyal yolları ağı tarafından kontrol edilir. Sinyal salınımlarının ve gradyanlarının sırasıyla segment oluşumunun zamanlamasını ve aralığını kontrol ettiği düşünülmektedir. İlgili sinyal yolları son yıllarda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, somitogenezi kontrol etmede sinyal salınımlarının işlevi için doğrudan kanıtlar eksiktir. Sinyal dinamiklerinin işlevsel olarak araştırılmasını sağlamak için, mikroakışkanlar bu dinamiklerin ince modülasyonu için önceden kurulmuş bir araçtır. Bu mikroakışkan tabanlı sürüklenme yaklaşımı ile endojen sinyal salınımları, yol modülatörlerinin darbeleri ile senkronize edilir. Bu, örneğin salınım periyodunun veya iki salınımlı yol arasındaki faz ilişkisinin modülasyonunu sağlar. Ayrıca, sinyal gradyanlarındaki spesifik değişikliklerin somitogenezi nasıl etkilediğini incelemek için yol modülatörlerinin uzamsal gradyanları doku boyunca kurulabilir.
Mevcut protokol, mikroakışkanların ilk kez kullanıcıları için mikroakışkan yaklaşımların oluşturulmasına yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bir mikroakışkan sistem kurmak için gereken temel prensipler ve ekipmanlar tanımlanmıştır ve çip üretimi için bir kalıbın bir 3D yazıcı kullanılarak kolayca hazırlanabileceği bir çip tasarımı sağlanmıştır. Son olarak, birincil fare dokusunun mikroakışkan bir çip üzerinde nasıl kültürleneceği ve sinyal salınımlarının yol modülatörlerinin dış darbelerine nasıl bağlanacağı tartışılmaktadır.
Bu mikroakışkan sistem, diğer bağlamlarda sinyal dinamiklerinin ve morfojen gradyanlarının fonksiyonel olarak araştırılması için gastruloidler ve organoidler gibi diğer in vivo ve in vitro model sistemlerini barındıracak şekilde de uyarlanabilir.
Introduction
Gelişim, sinyal yolları aracılığıyla hücreler arası iletişim ile kontrol edilir. Dokuların karmaşık oluşumunu ve uzay ve zamanda uygun hücre farklılaşmasını düzenleyen sınırlı sayıda sinyal yolu vardır. Bu çok sayıda süreci düzenlemek için, bilgi bir sinyal yolunun dinamiklerinde, bir sinyalin frekansı veya süresi gibi zaman içinde bir yolun değişiminde kodlanabilir1,2.
Somitogenez sırasında, somitik doku periyodik olarak presomitik mezodermden (PSM) ayrılır3. PSM, Wnt, Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF) ve Retinoik asit sinyalizasyonu gradyanları tarafından mekansal olarak düzenlenir. Wnt ve FGF sinyallerinin düşük olduğu belirleme cephesindeki anterior PSM’de, hücreler somitlere farklılaşmak üzere hazırlanır. Farklılaşma, bir transkripsiyonel aktivasyon dalgası bu belirleme cephesine ulaştığında meydana gelir. PSM içinde Wnt, FGF ve Notch sinyal salınımı olur. Komşu hücreler fazın biraz dışına salınır, bu da Wnt, FGF ve Notch yollarının posteriordan anterior PSM’ye giden salınımlı transkripsiyonel aktivasyon dalgalarıyla sonuçlanır. Fare embriyolarında, bir transkripsiyonel dalga yaklaşık her 2 saatte bir belirleme cephesine ulaşır ve somit oluşumunu başlatır. Sinyal yollarını bozarak veya aktive ederek somitogenezi incelemek, bu yolların önemini gösterebilir4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, hücresel davranışın kontrolünde sinyal dinamiklerinin işlevini araştırabilmek için, sinyal yollarını kalıcı olarak aktive etmek veya inhibe etmek yerine ince bir şekilde modüle etmek önemlidir.
Segmentasyon faresi embriyosundaki sinyal yolu aktivitesini geçici olarak modüle etmek için, Sonnen ve ark. mikroakışkan bir sistem geliştirmiştir10. Bu sistem, biyolojik numuneyi içeren bir çipin mikro kanalları içindeki sıvı akışlarının sıkı bir şekilde kontrol edilmesini sağlar11. PSM’nin uygun şekilde segmentasyonu için sinyal dinamiklerinin önemini incelemek için, bu mikroakışkan kurulumu, fare segmentasyon saatinin sinyal dinamiklerini ex vivo olarak modüle etmek için kullanılır. Yol aktivatörleri veya inhibitörleri kültür odasına sırayla darbelendirerek, Wnt, FGF ve Notch sinyalizasyonunun dinamiklerinin dış kontrolü sağlanır10. Örneğin, bireysel yolların periyodunu ve çoklu salınımlı sinyal yolları arasındaki faz ilişkisini değiştirmek mümkündür. Dinamik sinyal muhabirlerinin eşzamanlı gerçek zamanlı görüntülemesi kullanılarak, sürüklenmenin yolakların kendileri, farklılaşma ve somit oluşumu üzerindeki etkisi analiz edilebilir. Sinyal dinamikleri üzerindeki bu kontrol seviyesi kullanılarak, somitogenez sırasında Wnt- ve Notch-sinyal yolları arasındaki faz ilişkisinin önemi vurgulanmıştır10.
Kişiselleştirilmiş çip tasarımları, yerel ortamdaki mekansal zamansal pertürbasyonlar için çok sayıda seçeneğe izin verir, örneğin, kararlı gradyan oluşumu12,13,14,15, pulsatil aktivasyon/inhibisyon10,16,17,18 veya lokalize pertürbasyonlar19,20 . Mikroakışkanlar ayrıca deneysel kullanımın otomasyonu sayesinde daha tekrarlanabilir bir okuma ve daha yüksek verim sağlayabilir21,22,23. Mevcut protokol, mikroakışkanları ve dokulardaki endojen sinyal salınımlarının sürüklenmesini her standart yaşam bilimleri laboratuvarına getirmeyi amaçlamaktadır. Temiz oda ve yumuşak litografi ekipmanı gibi çip üretimi için sofistike ekipmanların yokluğunda bile, mikroakışkan çipler biyolojik soruları ele almak için üretilebilir ve kullanılabilir. Kalıplar, serbestçe kullanılabilen bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak tasarlanabilir. Genellikle polidimetilsiloksandan (PDMS) oluşan mikroakışkan çiplerin üretimi için bir kalıp, bir 3D yazıcı ile basılabilir veya baskı şirketlerinden sipariş edilebilir. Bu şekilde, mikroakışkan çipler pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymadan bir gün içinde üretilebilir24. Burada, iki boyutlu (2D) ex vivo kültürlerde25 fare segmentasyon saatinin sürüklenmesi için bir kalıbın bir 3D yazıcı ile basılabileceği bir çip tasarımı sağlanmıştır.
Mikroakışkanlar tarafından sağlanan çip üstü kültürler ve hassas pertürbasyonlar, sinyal yollarının çok hücreli davranışı nasıl kontrol ettiğinin moleküler mekanizmalarını çözmede olağanüstü bir potansiyele sahiptir. Sinyalizasyon dinamikleri ve morfojen gradyanları, gelişimdeki birçok süreç için gereklidir. Daha önce, laboratuvarlar mikroakışkan çiplerde kültürlenmiş hücrelere, dokulara ve tüm organizmalara sahipti ve öncelikle 2D hücre kültürünün mekansal zamansal pertürbasyonu için protokoller başka bir yerde sağlanmıştır12,26,27,28,29. Çok hücreli sistemlerde yerel ortamları modüle etmek için mikroakışkanların uygulanması, yüksek verimli ve hassas mekansal zamansal bozulmalar için yeni perspektifler açar. Mikroakışkanlar alanı artık gelişimsel biyologlar için uzman olmayan, ucuz ve kolayca uygulanabilir bir araç haline geldiği bir noktaya ulaşmıştır.
Burada, fare segmentasyon saatinin bir Çentik sinyal inhibitörünün darbelerine sürüklenmesi için bir protokol sağlanmıştır. Böyle bir deney aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) mikroakışkan çipin üretilmesi, (2) çipin boru ve kaplamasının hazırlanması ve (3) mikroakışkan deneyin kendisi (Şekil 1A). Omurgalı model sistemlerini içeren araştırmalar, sorumlu komiteden önceden etik onay gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinyal dinamiğinin çok hücreli sistemleri nasıl kontrol ettiği, bu alanda uzun süredir devam eden bir soru olmuştur. İşlevsel araştırma önemli bir zorluk teşkil eder, çünkü bu dinamiklerin buna izin vermek için ince bir şekilde modüle edilmesi gerekir11. Yol pertürbasyonları üzerindeki bu tür zamansal kontrol, prensip olarak, yüksek bir mekansal kontrol sağlayan optogenetik ile sağlanabilir34. Bununla birlikte, optogenetik, söz konusu her sinyal yolunun analizi için sofistike genetik araçların kurulmasını gerektirir. Burada açıklanan mevcut protokol, herhangi bir sinyal yolunun bozulması için çok yönlü bir araç sağlar. Mikroakışkanlar deneyi, doku kültürlerinde sinyal yolaklarının dinamiklerini fonksiyonel olarak araştırmak için geçici olarak kontrol edilen ilaç darbelerinin uygulanmasına izin verir. Burada, odak noktası ex vivo kültürlerde somitogenezin incelenmesidir, ancak protokol diğer model sistemlere uyacak şekilde uyarlanabilir.
Protokoldeki belirli adımlar, başarılı bir mikroakışkanlar deneyi gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir (Tablo 1’de özetlenmiştir). Anahtar noktalar aşağıdaki gibi tartışılmaktadır. Deney sırasında orta akış nedeniyle, doku kültürü kayma stresi yaşar. Model sistemin sürekli akışa maruz kalması, hücre stresine ve aşırı durumlarda kesme etkisine bağlı hücre ölümüne neden olabilir. Fare kuyruk tomurcuklarının ex vivo doku kültürleri ve mevcut çip tasarımı için, 60 μL / s’lik bir akış hızının (maksimum 100 μL / s) minimum kesme etkisiyle iyi çalıştığı bulunmuştur. Aynı talaş için birden fazla pompa aynı anda açıldığında, toplam debide bir artışa neden olmamak için her bir pompanın akış hızının buna göre ayarlanması gerekir. Mevcut protokol diğer model sistemlere ve çip tasarımlarına uyarlandığında, akış hızı optimize edilmelidir. Alternatif olarak, ortamı sürekli olarak yıkamamak, ancak çip üzerindeki ortamı periyodik olarak değiştirmek mümkündür35. Böyle bir kurulum, fare somitogenezindeki sinyal salınımlarını kontrol etmek için de uygulanabilir (yayınlanmamış, veriler gösterilmemiştir). Dahası, doku kültürlerinin doğrudan sıvı akışına maruz kalmadığı, ancak ilaçların komşu bir kanaldan difüzyon yoluyla dokuya ulaştığı bir kurulum da öngörülebilir. Bu tür sistemler, büyüme faktörlerinin gradyanlarını ESC farklılaşmasının in vitro modellerine uygulamak için başarıyla kullanılmıştır14,36.
Mikroakışkan deneylerin önemli bir konusu, deney sırasında çip üzerinde hava kabarcıklarının oluşmasıdır. Talaş veya boru içindeki hava kabarcıkları, çip üzerindeki düzgün sıvı akışına müdahale edebilir ve embriyo kültürünün bulunduğu yerden uzaklaştırılmasına neden olabilir. Hava kabarcıklarının varlığını önlemek için, protokolün çeşitli adımları vazgeçilmezdir. İlk olarak, şırıngalar içindeki kültür ortamı ve mikroakışkan çipin kendisi bir kurutucu kullanılarak gazdan arındırılmalıdır (adım 3.1.3). İkinci olarak, numuneleri yükleme girişlerine yüklerken, numuneyle birlikte çipe hava pipetlememeye dikkat edilmelidir (adım 3.2.3). Üçüncüsü, boruyu ortamla doldururken, çip takılmadan önce tüm hava kabarcıkları dışarı pompalanmalıdır (adım 3.3.2). Aksi takdirde, bu kabarcıklar deney sırasında ana çipe itilecektir. Son olarak, deney sırasında, yarı geçirgen boru nedeniyle ortam görüntüleme odası veya inkübatör içinde dengelenir. Borunun geçirgenliği aynı zamanda ortamın buharlaşmasına da izin verir, bu nedenle tüpte yeni kabarcıkların oluşumunu önlemek için deney sırasında nemin düzenlendiğinden emin olun.
Genel olarak, mikroakışkanlar, araştırmacının özel sorusuna uyarlanabilen çok yönlü bir araçtır. Mevcut tasarım yaklaşımı, çip başına paralel olarak 12 adede kadar ex vivo kültürün görüntülenmesini sağlar. Bu sayı esas olarak deney başına embriyo sayısı ve her embriyo kültürünü yeterli çözünürlükte görüntülemek için gereken süre ile sınırlıdır. Tek bir deneyde birden fazla koşulun karşılaştırılması gerekiyorsa, tek bir cam slayta birden fazla talaş monte edilebilir. Birden fazla doku eksplantının paralel olarak görüntülenmesi için ideal olan bir çip tasarımı sağlanır, ancak kişiselleştirilmiş tasarımlar, yüksek verim analizine izin vermek ve tek bir deneyde daha fazla koşulun kombinasyonunu artırmak için numune sayısındaki sınırlamaların üstesinden gelebilir16,17. Mikroakışkanlar, bir çip üzerinde kültürlenebilen modellerle sınırlıdır ve çip üzerindeki kültürün her model sistemi için ayrı ayrı optimize edilmesi gerekecektir27,37,38.
Son 5-10 yılda, mikroakışkanlar, yüksek verimli yaklaşımlar ve sinyal dinamikleri ve gradyanlarının ince modülasyonları için potansiyeli nedeniyle çeşitli biyolojik soruları ele almak için uygulanmıştır. Günümüzde mikroakışkanlar, laboratuvarların kolaylıkla kurabileceği kolay uygulanabilir, ucuz ve çok yönlü bir araç haline gelmiştir. Burada, mevcut protokol belirli bir uygulama için, yani somitogenezi yöneten sinyal dinamiklerini incelemek için optimize edilmiştir. Bu protokolü ve tasarımı, doku biyolojisindeki bireysel araştırma sorularına uyacak şekilde uyarlamak kolaydır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kalıpların 3D baskısı konusunda yardım için UMC Utrecht’ten Yang Li ve Jos Malda’ya, protokol hakkında çok yararlı geri bildirimler için Sonnen grubundan Karen van den Anker’e ve mikroskop içindeki mikroakışkan çiplerin tutucusu için Hubrecht Enstitüsü’ndeki mekanik atölyeden Tjeerd Faase’ye minnettarız. Tüm Sonnen grubuna makalenin eleştirel okuması için ve hakemlere yapıcı geri bildirimleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Araştırma Konseyi’nden K.F.S.’ye 850554 numaralı ERC başlangıç hibe anlaşması kapsamında fon aldı.
Materials
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
References
- Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
- Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
- Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
- Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding – From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
- Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
- Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
- Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
- Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
- Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
- Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
- Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
- Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
- Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
- Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF – Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
- Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data – pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
- Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
- Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).
