גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה
Summary
פרוטוקול לתרבות ומניפולציה של רקמת עובר עכבר על שבב microfluidic מסופק. על ידי החלת פולסים של אפננים מסלול, מערכת זו יכולה לשמש כדי לשלוט חיצונית תנודות איתות לחקירה פונקציונלית של סמיטוגנזה עכבר.
Abstract
פילוח תקופתי של המזודרם הפרזומיטי של עובר עכבר מתפתח נשלט על ידי רשת של מסלולי איתות. תנודות איתות ושיפועים נחשבים לשלוט על התזמון והמרווח של היווצרות קטע, בהתאמה. בעוד מסלולי איתות המעורבים נחקרו בהרחבה בעשורים האחרונים, ראיות ישירות לתפקוד של איתות תנודות בשליטה סומיטוגנזה כבר חסר. כדי לאפשר חקירה פונקציונלית של דינמיקת איתות, microfluidics הוא כלי שהוקם בעבר עבור אפנון עדין של דינמיקה זו. עם זה microfluidics מבוסס entrainment גישה אנדוגני איתות תנודות מסונכרנות על ידי פולסים של אפננים מסלול. זה מאפשר אפנון של, למשל, תקופת התנודה או את הפאזה-יחסים בין שני מסלולים מתנדנדים. יתר על כן, שיפועים מרחביים של אפננים מסלול ניתן להקים לאורך הרקמה כדי ללמוד כיצד שינויים ספציפיים בשיפועי איתות להשפיע על סמיטוגנזה.
הפרוטוקול הנוכחי נועד לעזור ליצור גישות מיקרופלואידיות עבור המשתמשים הראשונים של מיקרופלואידיקה. העקרונות הבסיסיים והציוד הדרושים להקמת מערכת מיקרופלואידית מתוארים, וניתן עיצוב שבב, שאיתו ניתן להכין תבנית לייצור שבבים בנוחות באמצעות מדפסת תלת-ממד. לבסוף, כיצד לתרבות רקמת עכבר ראשית על שבב microfluidic וכיצד לאמן תנודות איתות לפולסים חיצוניים של אפננים מסלול נדונים.
מערכת מיקרופלואידית זו יכולה להיות מותאמת גם לאספקת מערכות מודל אחרות של vivo ו – vio במבחנה כגון gastruloids ו organoids לחקירה פונקציונלית של דינמיקת איתות ושיפועי מורפוגן בהקשרים אחרים.
Introduction
הפיתוח נשלט על ידי תקשורת בין-תאית באמצעות מסלולי איתות. יש רק מספר מוגבל של מסלולי איתות המתזמרים היווצרות מורכבת של רקמות ובידול תאים נכון במרחב ובזמן. כדי לווסת את ריבוי התהליכים, מידע יכול להיות מקודד בדינמיקה של מסלול איתות, שינוי מסלול לאורך זמן, כגון תדירות או משך של אות 1,2.
במהלך סמיטוגנזה, רקמה סומיטית מחולקת מעת לעת מן mesoderm presomitic (PSM)3. ה- PSM מאורגן באופן מרחבי על ידי שיפועים של Wnt, גורם גדילה פיברובלסט (FGF) ואיתות חומצה רטינואית. ב- PSM הקדמי בחזית הקביעה, כאשר אותות Wnt ו- FGF נמוכים, התאים מוכנים לבידול לסומיטים. הבחנה מתרחשת כאשר גל של הפעלה תמלולית מגיע לחזית קביעה זו. בתוך PSM, Wnt, FGF, ו Notch איתות תנודה. תאים שכנים מתנדנדים מעט מחוץ לפאזה, מה שגורם לגלים של הפעלה תמלולית מתנדנדת במורד הזרם של מסלולי Wnt, FGF ו- Notch הנוסעים מהחלק האחורי ל- PSM הקדמי. בעוברי עכבר, גל תמלול מגיע לחזית הקביעה בערך כל 2 שעות ויוזם היווצרות מוכה. לימוד סומיטוגנזה על ידי הפרעה או הפעלה של מסלולי איתות יכול להמחיש את החשיבות של מסלולים אלה4,5,6,7,8,9. עם זאת, כדי להיות מסוגל לחקור את הפונקציה של דינמיקת איתות בשליטה של התנהגות הסלולר, זה חיוני כדי לווסת בעדינות נתיבי איתות במקום להפעיל או לעכב אותם לצמיתות.
כדי לווסת זמנית את פעילות מסלול האיתות בתוך עובר העכבר פילוח, Sonnen ואח ‘ פיתחו מערכת מיקרופלואידית10. מערכת זו מאפשרת שליטה הדוקה של זורם נוזלים בתוך מיקרוצנלים של שבב המכיל את המדגם הביולוגי11. כדי ללמוד את החשיבות של דינמיקת איתות עבור פילוח נכון של PSM, התקנה זו microfluidics מנוצל כדי לווסת את הדינמיקה איתות של שעון פילוח העכבר ex vivo. על ידי מפעילי מסלול פועם ברצף או מעכבים לתוך תא התרבות, שליטה חיצונית של הדינמיקה של Wnt, FGF, ו Notch איתות מושגת10. לדוגמה, ניתן לשנות את התקופה של מסלולים בודדים ואת יחסי הפאזה בין מסלולי איתות מתנדנדים מרובים. באמצעות הדמיה בזמן אמת בו זמנית של כתבי איתות דינמיים, ניתן לנתח את ההשפעה של אימון על המסלולים עצמם, על בידול ועל היווצרות סומיט. באמצעות רמה זו של שליטה על דינמיקת איתות, החשיבות של יחסי הפאזה בין Wnt – ו Notch איתות מסלולים במהלך somitogenesis הודגש10.
עיצובי שבבים מותאמים אישית מאפשרים שפע של אפשרויות להפרעות מרחביות בתוך הסביבה המקומית, למשל, היווצרות שיפוע יציבה12,13,14,15, הפעלה/עיכוב פועם10,16,17,18 או הפרעות מקומיות19,20 . Microfluidics יכול גם לאפשר קריאה לשחזור יותר ותפוקה גבוהה יותר עקב אוטומציה של טיפול ניסיוני21,22,23. הפרוטוקול הנוכחי נועד להביא מיקרופלואידיקה ו entrainment של תנודות איתות אנדוגני בתוך רקמות לכל מעבדת מדעי החיים סטנדרטית. גם בהיעדר ציוד מתוחכם לייצור שבבים, כגון חדר נקי וציוד לליתוגרפיה רכה, ניתן לייצר שבבים מיקרופלואידיים ולהשתמש בהם כדי לענות על שאלות ביולוגיות. ניתן לעצב תבניות באמצעות תוכנת עיצוב (CAD) הזמינה באופן חופשי בעזרת מחשב. תבנית לייצור שבבים מיקרופלואידיים, המורכבת בדרך כלל מפולידימתילסילוקסן (PDMS), ניתנת להדפסה עם מדפסת תלת-ממד, או להזמין מחברות הדפסה. בדרך זו, שבבים microfluidic ניתן לייצר בתוך יום אחד ללא הדרישה של ציוד יקר24. כאן, עיצוב שבב מסופק, שבו עובש עבור entrainment של שעון פילוח העכבר בתרבויות ex vivo דו-ממדי (2D) ex vivo25 ניתן להדפיס עם מדפסת 3D.
תרביות על שבב ו ההפרעות המדויקות, המופעלות על ידי מיקרופלואידיקה, מחזיקות בפוטנציאל יוצא מן הכלל בפענוח המנגנונים המולקולריים של האופן שבו מסלולי איתות שולטים בהתנהגות רב-תאית. דינמיקת איתות ושיפועי מורפוגן נדרשים לתהליכים רבים בפיתוח. בעבר, מעבדות היו תאים תרבית, רקמות ואורגניזמים שלמים שבבים microfluidic ופרוטוקולים עבור הפרעה spatiotemporal של תרבית תאים דו-ממדיים בעיקר מסופקים במקומות אחרים 12,26,26,27,28,29. החלת מיקרופלואידיקה לווסת סביבות מקומיות במערכות רב-תאיות פותחת נקודות מבט חדשות עבור הפרעות מרחביות בעלות תפוקה גבוהה ומדויקות. תחום המיקרופלואידיקה הגיע כעת לנקודה שהוא הפך לכלי לא מומחה, זול וישים בקלות לביולוגים התפתחותיים.
כאן, פרוטוקול עבור entrainment של שעון פילוח העכבר לפולסים של מעכב איתות חריץ מסופק. ניסוי כזה מורכב מהשלבים הבאים: (1) ייצור שבב מיקרופלואידי, (2) הכנת צינורות וציפוי של השבב, ו-(3) הניסוי המיקרופלואידי עצמו (איור 1A). מחקרים הקשורים למערכות מודל בעלי חוליות דורשים אישור אתי מוקדם מהוועדה האחראית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כיצד דינמיקת האיתות שולטת במערכות רב-תאיות הייתה שאלה ארוכת שנים בתחום. חקירה פונקציונלית מהווה אתגר מרכזי, כי הדינמיקה הזאת צריכה להיות מאופננת בעדינות כדי לאפשר את זה11. שליטה זמנית כזו על הפרעות מסלול ניתן להשיג באופן עקרוני עם אופטוגנטיקה, אשר מאפשר גם שליטה מרחבית גבוהה34. עם זאת, אופטוגנטיקה דורשת הקמת כלים גנטיים מתוחכמים לניתוח כל מסלול איתות המדובר. הפרוטוקול הנוכחי המתואר כאן מספק כלי רב תכליתי מאוד עבור ההפרעה של כל מסלול איתות. ניסוי המיקרופלואידיקה מאפשר יישום של פולסים תרופתיים מבוקרים זמנית כדי לחקור באופן פונקציונלי את הדינמיקה של מסלולי איתות בתרביות רקמות. כאן, ההתמקדות היא בחקר סומיטוגנזה בתרבויות ex vivo , אך ניתן להתאים את הפרוטוקול כך שיתאים לכל מערכות מודל אחרות.
שלבים מסוימים בפרוטוקול הם קריטיים לביצוע ניסוי מוצלח במיקרופלואידיקה (המסוכם בטבלה 1). נקודות מפתח נדונות כדלקמן. בשל זרימה בינונית במהלך הניסוי, תרבית הרקמה חווה מתח גזירה. חשיפה של מערכת המודל לזרימה רציפה יכולה לגרום ללחץ תאי ובמקרים קיצוניים למוות של תאים עקב אפקט הגזירה. עבור תרביות רקמת ex vivo של tailbuds העכבר ואת עיצוב השבב הנוכחי, קצב זרימה של 60 μL / h (מקסימום של 100 μL / h) נמצא לעבוד היטב עם אפקט גזירה מינימלי. כאשר משאבות מרובות מופעלות בו זמנית עבור אותו שבב, קצב הזרימה של משאבות בודדות צריך להיות מותאם בהתאם כדי לא לגרום לעלייה בקצב הזרימה הכולל. כאשר הפרוטוקול הנוכחי מותאם למערכות מודל אחרות ולעיצובי שבבים, יש למטב את קצב הזרימה. לחלופין, ניתן לא לשטוף בינוני ברציפות, אבל מעת לעת לשנות מדיום על השבב35. התקנה כזו יכולה להיות מיושמת גם על תנודות איתות בקרה בסומיטוגנזה של העכבר (לא פורסם, נתונים לא מוצגים). יתר על כן, ניתן גם לדמיין התקנה, שבה תרביות רקמות אינן חשופות לזרימת נוזלים ישירה, אך תרופות מגיעות לרקמה על ידי דיפוזיה מערוץ סמוך. מערכות כאלה שימשו בהצלחה כדי להחיל שיפועים של גורמי גדילה על מודלים במבחנה של בידול ESC14,36.
נושא מרכזי אחד של ניסויים מיקרופלואידיים הוא התרחשות של בועות אוויר על שבב במהלך הניסוי. בועות אוויר בתוך השבב או הצינורות עלולות להפריע לזרימה נוזלית אחידה על השבב ויכולות להוביל להסרת תרבות העובר ממיקומה. כדי למנוע נוכחות של בועות אוויר, צעדים שונים של הפרוטוקול הם הכרחיים. ראשית, מדיום תרבות בתוך מזרקים ואת השבב microfluidic עצמו חייב להיות degassed באמצעות ייבוש (שלב 3.1.3). שנית, בעת טעינת דגימות לתוך מפרצוני הטעינה, יש להיזהר שלא להזרים אוויר לתוך השבב יחד עם המדגם (שלב 3.2.3). שלישית, בעת מילוי הצינורות עם בינוני, כל בועות האוויר חייב להיות נשאב החוצה לפני הצמדת השבב (שלב 3.3.2). אחרת, בועות אלה יידחפו לתוך השבב הראשי במהלך הניסוי. לבסוף, במהלך הניסוי, המדיום הוא שיווי משקל בתוך תא ההדמיה או החממה בשל צינורות חדיר למחצה. חדירות הצינור מאפשרת גם אידוי של המדיום, לכן ודא כי הלחות מווסתת במהלך הניסוי כדי למנוע היווצרות של בועות חדשות בצינורות.
באופן כללי, microfluidics הוא כלי רב תכליתי מאוד שניתן להתאים לשאלה הספציפית של החוקר. הגישה העיצובית הנוכחית מאפשרת הדמיה של עד 12 תרביות ex vivo במקביל לשבב. מספר זה מוגבל בעיקר על ידי מספר העוברים לכל ניסוי והזמן שלוקח לדמיין כל תרבות עובר ברזולוציה מספקת. אם יש צורך להשוות תנאים מרובים בניסוי יחיד, ניתן להרכיב שבבים מרובים על שקופית זכוכית אחת. עיצוב שבב מסופק, אשר אידיאלי עבור הדמיה של explants רקמות מרובות במקביל, אבל עיצובים מותאמים אישית יכולים להתגבר על מגבלות במספר המדגם כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ולהגדיל את השילוב של תנאים נוספים בתוך ניסוי אחד16,17. Microfluidics מוגבלת לדגמים שניתן לתרבות על שבב ותרבות על שבב יהיה צורך אופטימיזציה עבור כל מערכת מודל בנפרד 27,37,38.
במהלך 5-10 השנים האחרונות, microfluidics יושם כדי לטפל בשאלות ביולוגיות שונות בשל הפוטנציאל שלה גישות תפוקה גבוהה אפנון עדין של דינמיקת איתות ושיפועים. כיום, מיקרופלואידיקה הפכה לכלי ישים, זול ורב-תכליתי בקלות שמעבדות יכולות להקים בקלות. כאן, הפרוטוקול הנוכחי ממוטב עבור יישום מסוים, כלומר, לימוד דינמיקת איתות השולטת בסמיטוגנזה. זה פשוט להתאים את הפרוטוקול הזה ואת העיצוב כדי להתאים את שאלות מחקר בודדים בביולוגיה רקמות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליאנג לי וג’וס מלדה מאוטרכט UMC על העזרה בהדפסת תבניות בתלת-ממד, קארן ואן דן אנקר מקבוצת זונן על משוב שימושי מאוד על הפרוטוקול, וטג’רד פאזה מהסדנה המכנית במכון הוברכט למחזיק שבבים מיקרופלואידיים בתוך המיקרוסקופ. ברצוננו להודות לכל קבוצת Sonnen על הקריאה הביקורתית של כתב היד והסוקרים על המשוב הבונה שלהם. עבודה זו קיבלה מימון ממועצת המחקר האירופית במסגרת הסכם מענק התחלתי של ERC מס ‘ 850554 ל- K.F.S.
Materials
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
References
- Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
- Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
- Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
- Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
- Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
- Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
- Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding – From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
- Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
- Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
- Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
- Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
- Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
- Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
- Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
- Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
- Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
- Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
- Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
- Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
- Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
- Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF – Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
- Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data – pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
- Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
- Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
- Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).
