Un approccio microfluidico per l'indagine funzionale delle oscillazioni di segnalazione che governano la somitogenesi

La ricerca qui presentata è stata approvata dal comitato etico EMBL10 e dal comitato olandese per la ricerca sugli animali (dierenexperimentencommissie, DEC) e segue le linee guida Hubrecht per la cura degli animali. Indossare guanti mentre si lavora con PDMS liquido. Coprire superfici e attrezzature. Rimuovere immediatamente eventuali fuoriuscite, poiché la pulizia diventa difficile una volta indurita. 1. Generazione del chip NOTA: I chip microfluidici sono generati dalla fusione di PDMS (polidimetilsilossano) in uno stampo. Gli stampi possono essere progettati utilizzando software CAD (ad esempio, uFlow o 3DμF30). Un archivio di progetti gratuiti è fornito dal MIT (Metafluidics.org). Gli stampi vengono stampati con una stampante 3D o possono essere generati mediante litografia morbida utilizzando una fotomaschera che contiene il design desiderato (per ulteriori informazioni vedere, ad esempio, Qin et al., 201031). Qui, viene fornito un design per uno stampo che può essere stampato con una stampante 3D per la coltura su chip del tessuto embrionale di topo (Figura 1B, C, File supplementari 1 e 2). Per consentire la stampa con stampanti 3D a bassa risoluzione, il design è stato modificato rispetto a quello precedentemente pubblicato10. Viene fornito uno stampo senza trappole a bolle d’aria e uno con trappole a bolle d’aria (file supplementari 1 e 2, rispettivamente). Poiché la procedura di stampa dipende dalla stampante disponibile, i dettagli per la stampa non verranno descritti. Tuttavia, è necessario assicurarsi che tutta la resina non polimerizzata sia completamente rimossa. Spesso è necessario eseguire un lavaggio extra con solventi per rimuovere la resina non polimerizzata dai piccoli fori < 200 μm all'interno della camera microfluidica. Questi fori formeranno pilastri PDMS per intrappolare il tessuto embrionale all'interno del chip durante l'esperimento. PDMS è generalmente utilizzato per la microfluidica, in quanto è economico, biocompatibile e trasparente e ha una bassa autofluorescenza. Dopo la polimerizzazione, il chip PDMS viene tagliato fuori dallo stampo e incollato su una diapositiva di vetro. Il trattamento al plasma sia del vetro che del chip PDMS attiva le superfici e consente la formazione di legami covalenti, quando messi a contatto. Preparare la quantità richiesta di PDMS mescolando il monomero con il catalizzatore in un rapporto 9:1 (w:w) per indurre la polimerizzazione. Usa strumenti usa e getta per mescolare, come bicchieri di plastica e forchette. Assicurarsi che la miscelazione sia correttamente raggiunta. Posizionare la miscela PDMS in un essiccatore e applicare il vuoto per circa 30 minuti per rimuovere l’aria dalla miscela PDMS. A causa del vuoto all’interno dell’essiccatore, l’aria verrà rimossa dalla miscela PDMS.NOTA: Coprire l’interno dell’essiccatore con fazzoletti nel caso in cui il PDMS scorra. Versare la miscela PDMS nello stampo del chip (è sufficiente uno strato PDMS di circa 3-5 mm). Riposizionare lo stampo riempito con PDMS nell’essiccatore e applicare il vuoto per rimuovere eventuali bolle rimanenti. Assicurarsi che l’aria venga rimossa da tutte le strutture più piccole dello stampo. Polimerizzare lo stampo mettendolo in un forno a 65 °C (o inferiore a seconda del materiale dello stampo) durante la notte. Tagliare il chip dallo stampo usando un bisturi. Tagliare il PDMS temprato dallo stampo con spazio sufficiente (1-2 cm) attorno al design per consentire un successivo incollaggio. Assicurati di tagliare completamente il PDMS per evitare la rottura del chip quando lo estrai. Sollevare il chip PDMS con attenzione, prima con l’estremità smussata del bisturi e, quando possibile, con le mani. Fori di ingresso e di uscita, a partire dall’interno della camera microfluidica utilizzando un punzone per biopsia da 1 mm. Pulire brevemente il chip PDMS con aria compressa e nastro adesivo adesivo su entrambi i lati per rimuovere eventuali frammenti di PDMS e polvere bloccati e mantenerlo pulito fino a nuovo utilizzo.NOTA: Il chip può essere conservato in questo modo fino a un ulteriore utilizzo. Pulire la slitta di vetro con aria compressa. Fai attenzione che non si rompa. Rimuovere il nastro adesivo dal chip PDMS. Legare il chip al vetrino usando un forno al plasma. Le seguenti istruzioni sono ottimizzate per il plasma d’aria.NOTA: Consultare il manuale del forno al plasma del laboratorio e ottimizzare la procedura per l’esperimento specifico. Posizionare il chip e il vetrino nel forno al plasma con i lati da incollare rivolti verso l’alto. Posizionare il coperchio sul forno al plasma e tenerlo in posizione durante l’applicazione del vuoto e attendere che il vuoto si sia stabilito. Accendere il gas premendo il pulsante Gas e attendere circa 1 minuto (la pressione dovrebbe essere di circa 0,37 mbar). Generare plasma premendo Generator (Potenza: 9.0, Tempo: 1 min). Al termine, spegnere la pompa e il gas; ventilare e aprire la porta. Legare il chip al vetro posizionando le superfici attivate l’una sull’altra e applicando la pressione in modo uniforme. Fare attenzione che il vetro non si rompa.NOTA: è possibile eseguire un test dell’acqua per confermare che il trattamento al plasma ha funzionato. Posizionare una goccia d’acqua sulla superficie del vetro. Se il trattamento al plasma ha funzionato, l’acqua dovrebbe diffondersi immediatamente invece di formare una goccia. Mettere il truciolo incollato in forno a 65 °C per 5 minuti. Sigillare il lato esposto del chip con nastro adesivo per evitare che la polvere penetri nelle prese.NOTA: Il chip può essere conservato fino all’uso. Le aperture devono essere chiuse con nastro adesivo fino ad allora. 2. Preparazione dell’esperimento di microfluidica NOTA: per eseguire l’esperimento di microfluidica sono necessarie le seguenti fasi preparatorie: in primo luogo, quando si esegue l’esperimento di microfluidica, viene creato un flusso di fluido dalle entrate alle uscite. Eventuali fori nel chip funzioneranno come uscite a causa dell’accumulo di pressione dalle prese. Pertanto, tutti i fori che non vengono utilizzati devono essere chiusi; ad esempio, fori che vengono utilizzati per caricare il tessuto sul chip. Se questi non sono chiusi, il tessuto potrebbe fuoriuscire con il fluido. Per chiudere questi fori, vengono utilizzati tubi riempiti di PDMS. Il tubo riempito con PDMS può essere conservato a tempo indeterminato e, pertanto, non dovrà essere preparato separatamente per ogni esperimento di microfluidica, ma può essere realizzato in lotti più grandi. In secondo luogo, prima dell’inizio dell’esperimento microfluidico, i tubi, i tubi riempiti con PDMS e il chip, necessario per l’esperimento, vengono preparati e sterilizzati ai raggi UV. Infine, il chip deve essere rivestito con fibronectina, in modo che il tessuto embrionale possa attaccarsi al vetro25. Realizzazione di tubi riempiti di PDMS. Prendi ±1 m di tubo. Più tubi possono essere riempiti con PDMS prendendo più pezzi di tubo. Preparare la quantità richiesta di PDMS mescolando il monomero con il catalizzatore in un rapporto 9:1 (w:w) per indurre la polimerizzazione.NOTA: utilizzare strumenti usa e getta per mescolare, come bicchieri di plastica e forchette. Mescolare correttamente. Posizionare la miscela PDMS in un essiccatore e applicare il vuoto per circa 30 minuti per rimuovere l’aria dalla miscela PDMS.NOTA: Coprire l’interno dell’essiccatore con fazzoletti nel caso in cui il PDMS scorra. Riempire una siringa da 3 ml con PDMS. Riempire con attenzione per evitare la formazione di bolle d’aria nella miscela. Utilizzare una pinza per inserire la punta di un ago da 22 G nel tubo.NOTA: Fare attenzione a non perforare il tubo o le dita con l’ago. Attaccare il tubo alla siringa riempita di PDMS tramite l’ago. Utilizzare la pompa a siringa per riempire il tubo, con una portata di circa 500 μL/h. Fare attenzione a non applicare una pressione troppo elevata per evitare la rottura della pompa. Una volta che il tubo è interamente riempito con PDMS, metterlo in un piatto di 15 cm e polimerizzare a temperatura ambiente (almeno durante la notte). Preparare il tubo e il chip per l’esperimento.NOTA: per l’esperimento è necessario il seguente tubo: in primo luogo, circa 50 cm di tubo per uscita e in secondo luogo, circa 2-3 m per ingresso (la dimensione esatta dipende dall’organizzazione spaziale delle pompe, dell’incubatore o del microscopio utilizzati in seguito). Il tubo di ingresso deve essere lungo per consentire al terreno di coltura di equilibrarsi con CO2 per la coltura embrionale durante l’esperimento. Tagliare il tubo con un angolo di 45° in modo da creare estremità appuntite; questo renderà più facile inserire il tubo nei fori del chip. Attaccare un ago a ciascuno dei tubi di ingresso. Vedere il passaggio 2.1.5. Tagliare tubi riempiti di PDMS in tappi ±1 cm. Tagliare con un angolo di 45° in modo da creare estremità appuntite; questo renderà più facile inserire il tubo nei fori del chip. Sono necessari abbastanza tappi per riempire ogni foro che non è collegato a nessun tubo. Rimuovere il nastro adesivo dal chip. Posizionare tutto il tubo con gli aghi attaccati, il chip e i tappi in un piatto e sterilizzare esponendo alla luce UV per ±15 minuti. È possibile utilizzare qualsiasi cappa di coltura cellulare con possibilità di sterilizzazione UV. Rivestimento di chip con fibronectina.NOTA: Per la coltura di colture 2D ex vivo di PSM posteriore, rivestire il chip con fibronectina. Posizionare il chip in un becher contenente PBS + 1% Penicillina / Streptomicina a temperatura ambiente. Assicurarsi che il chip sia completamente coperto da PBS. Lavare il chip con PBS per rimuovere l’aria con una pipetta P200.NOTA: Tutta l’ulteriore manipolazione del chip verrà eseguita in questo becher fino all’inizio dell’esperimento per impedire l’ingresso di aria nel chip. Fare attenzione a non rompere la diapositiva di vetro del chip. Preparare 2 ml di fibronectina 1:20 in PBS e riempire un becher. Caricare una siringa da 3 ml per ogni camera del chip. Con una pinza, inserire un ago da 22 G nel tubo di uscita. Attaccare l’ago alla siringa contenente fibronectina. Collegare la siringa alla pompa della siringa. Lavare il tubo, fino a quando non c’è aria rimasta nel tubo. Collegare il tubo di uscita all’uscita del chip. Assicurati di spingere il tubo fino in fondo. Impostare una portata bassa per rivestire il chip. Tutte le altre aperture possono rimanere aperte. Lasciare funzionare la pompa della siringa per almeno 2 ore, può funzionare anche durante la notte. Arrestare la pompa. Tagliare il tubo subito dopo l’ago. Il tubo rimanente servirà come uscita durante l’esperimento successivo. 3. Esperimento di microfluidica NOTA: Qui viene presentato un protocollo per il trascinamento dell’orologio di segmentazione del mouse in colture 2D ex vivo applicando impulsi dell’inibitore di segnalazione Notch DAPT. L’applicazione di impulsi con un periodo di 130 minuti, vicino al periodo naturale dell’orologio di segmentazione del mouse (137 min25), consente un trascinamento efficiente. Vengono applicati impulsi di 100 min di mezzo e 30 min di 2 μM DAPT (Figura 2A). La presenza di farmaco all’interno del chip viene monitorata utilizzando un colorante fluorescente. Gli spettri di eccitazione ed emissione di questo colorante e del segnalatore di segnalazione fluorescente devono essere abbastanza diversi da prevenire il sanguinamento durante l’imaging in tempo reale a fluorescenza. Quando le proteine fluorescenti gialle vengono utilizzate come reporter di segnalazione, come il reporter di segnalazione Notch LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), il colorante, Cascade Blue, può essere applicato. Per identificare altre possibili combinazioni di colorante fluorescente e reporter, è possibile utilizzare un visualizzatore di spettri liberamente disponibile. L’effetto del trascinamento può essere rilevato dall’imaging in tempo reale dei segnalatori di segnalazione dinamica5,10,32. Ogni chip ha due camere di incubazione. Ciò consente il confronto diretto degli impulsi dei farmaci (DAPT) per controllare gli impulsi (DMSO). Fare media e degas. Il giorno dell’esperimento, preparare 50 ml di terreno di coltura (DMEM-F12 integrato con 0,5 mM di glucosio, 2 mM di glutammina e 1% di BSA, per ulteriori informazioni sulla coltura del bocciolo di coda del topo vedi25). Preparare le siringhe riempite con il mezzo per l’esperimento. Preparare il terreno di coltura nei becher: per intrappolare le oscillazioni di segnalazione Notch, preparare 6 mL di terreno con 1,2 μL di DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 mL di terreno di coltura con 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; due tubi con 6 ml di media ciascuno. Utilizzare almeno 6 ml di mezzo per siringa. Caricare le siringhe con il mezzo. Assicurarsi di etichettare le siringhe contenenti farmaco e DMSO. Degasare il chip all’interno di PBS e le siringhe contenenti il mezzo in un essiccatore. Posizionare le siringhe in un becher con la punta rivolta verso l’alto, in modo che l’aria possa fuoriuscire nella parte superiore. Potrebbe accadere che il chip galleggi ed è ancora pieno di bolle. Questi saranno rimossi successivamente. Prova a scovare / aspirare la maggior parte delle bolle d’aria dal chip usando una pipetta P200. Se rimane un po ‘ d’aria, questo verrà rimosso durante il seguente esperimento. Installare le siringhe nelle pompe e collegare i tubi di ingresso alle siringhe. Per intrappolare la segnalazione Notch, utilizzare due pompe a siringa, una che trasporta le siringhe medie, una che trasporta le siringhe del farmaco / DMSO. Lasciare che questo funzioni a una portata più elevata (0,5 ml / h) fino all’inizio dell’esperimento per rimuovere le bolle d’aria dal tubo. Fare attenzione a impostare correttamente i dettagli della siringa (diametro) nella pompa. Caricamento del tessuto sul chip. Sezionare il tessuto embrionale di topo. Seziona la punta più posteriore della coda (bocciolo di coda). Posizionare il tessuto sezionato in terreno di coltura + 25 μM HEPES. Lavare il chip con terreno di coltura + 25 μM HEPES utilizzando un P200 per rimuovere PBS. Caricare il tissue nel chip utilizzando una pipetta P200 (Figura 1C). Assicurarsi di non introdurre bolle d’aria nel chip.NOTA: il caricamento efficiente richiede un po’ di pratica. Se il tessuto non è orientato correttamente, potrebbe essere possibile girarlo aspirando con cura e lavando di nuovo. Tuttavia, questo spesso si traduce in una rapida morte cellulare. Dopo ogni fase di caricamento del tessuto, chiudere l’ingresso di carico del tessuto corrispondente utilizzando un pezzo di tubo riempito di PDMS. Assicurarsi che i tappi siano sufficientemente spinti verso il basso sul fondo del chip usando pinzette smussate. Dopo che tutti i campioni sono stati caricati, chiudere eventuali ingressi / uscite inutilizzati con pezzi di tubi riempiti di PDMS usando una pinza smussata. Assemblaggio di setup microfluidico. Abbassare la portata delle pompe microfluidiche. 60-100 μL/h funziona bene per i boccioli di coda degli embrioni di topo. A portate più elevate, è stata osservata la morte cellulare, presumibilmente a causa di un taglio cellulare troppo elevato. La portata cumulativa di più pompe non deve superare questi 60-100 μL/h per camera microfluidica in un dato momento. Collegare il tubo al chip microfluidico. Fallo senza ottenere bolle d’aria all’interno del chip (questo può essere ottenuto assicurandoti che ci sia una goccia di mezzo presente all’estremità del tubo). Le prese sono ancora presenti dal rivestimento in fibronectina (vedere 2.3). Una volta che tutti i tubi sono attaccati al chip, estrarlo dal becher, asciugarlo correttamente, metterlo in un piatto e metterlo insieme con circa 1,5 m di tubo di ingresso in un incubatore (37 ° C, 20% O2, 5% CO2) per la coltura notturna. Il tubo è permeabile al gas; ciò consentirà l’equilibrio di O2 e CO2 nel mezzo. In alternativa, per l’imaging simultaneo in tempo reale a fluorescenza, il chip e il tubo di ingresso di circa 1,5 m vengono inseriti direttamente nel microscopio. Un supporto per il chip, che si adatta ai supporti standard a 96 pozzetti, è fornito nel file supplementare 3.NOTA: Assicurarsi che l’umidità sia abbastanza alta durante l’incubazione. Se necessario, aggiungere un tessuto umido alla camera di imaging o all’incubatore per evitare l’evaporazione nella configurazione microfluidica. Se l’umidità nell’incubatore del microscopio è troppo bassa, ciò si traduce nella formazione di bolle d’aria nel tubo e nel chip microfluidico. È quindi possibile utilizzare una scatola di imaging chiusa, in cui sono posizionati chip e tubi. Il modo più semplice per realizzare una tale scatola di imaging è posizionare un grande coperchio sopra il chip e aggiungere un tessuto bagnato, non deve essere chiuso completamente. Assicurarsi che la differenza di altezza tra pompa e chip non sia troppo grande e, se necessario, modificare le altezze lentamente per evitare la formazione di bolle d’aria dovute alla gravità. Lasciare che tutte le pompe scorrano a una portata di 20 μL/h per 20 minuti, dopo che la configurazione è stata posizionata nella sua posizione finale. Poiché la camera e la pompa si sono probabilmente spostate in altezza, ciò è necessario per ristabilire la pressione corretta nel tubo. Spegnere la pompa del farmaco, lasciare che solo la pompa media funzioni a 60 μL / h fino all’inizio dell’esperimento / imaging in tempo reale. Inizio dell’esperimento. Avviare il programma di pompaggio pianificato per l’esperimento. Per intrappolare la segnalazione notch, utilizzare un programma di pompaggio di impulsi di droga medi di 100 minuti e 30 minuti, che viene ripetuto fino alla fine dell’esperimento, in genere per 24 ore.NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi pompa microfluidica programmabile. Nel formato più semplice, le pompe possono essere programmate e avviate manualmente. In alternativa, le pompe possono essere controllate da un software per computer. Nel caso in cui venga eseguita l’imaging in tempo reale, avviare l’imaging dopo un periodo di almeno 30 minuti. Ciò consentirà alla temperatura del chip di adattarsi alla temperatura all’interno dell’incubatore e prevenire una deriva troppo forte durante l’imaging. L’autofocus è ancora utile. Eseguire l’imaging confocale standard tramite il vetrino del chip utilizzando un microscopio invertito. Utilizzare un intervallo di imaging di 10 minuti per rilevare sufficientemente le oscillazioni di segnalazione con un periodo di 130 minuti. Per periodi più brevi, accorciare l’intervallo per un campionamento sufficiente. Includi una traccia di imaging a bassa risoluzione per il rilevamento di Cascade Blue per visualizzare la presenza di farmaco sul chip. Per l’eccitazione di un reporter di Venere, utilizzare un laser a 515 nm o un laser a 2 fotoni a una lunghezza d’onda di 960 nm. Acquisire una pila z di 6-8 piani con una distanza di 8 μm attraverso un obiettivo di piano 20x (risoluzione 512 x 512 pixel, 1,38 μm / pixel). Usa uno stadio motorizzato per visualizzare più campioni all’interno di un esperimento. Eccita Cascade Blue con un laser a 405 nm e acquisisci un singolo piano z ogni 10 minuti (risoluzione 32 x 32 pixel, 22,14 μm/pixel).NOTA: Ulteriori informazioni sull’imaging e l’analisi delle immagini sono fornite nei risultati rappresentativi e sono disponibili nel riferimento10.