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Developmental Biology

Uma abordagem microfluidics para a investigação funcional de oscilações de sinalização que regem a Somitogênese

Published: March 19, 2021
doi:
10.3791/62318
, ,
1Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center Utrecht

Summary

Um protocolo para a cultura e manipulação do tecido embrionário do rato em um chip microfluido é fornecido. Aplicando pulsos de moduladores de via, este sistema pode ser usado para controlar externamente as oscilações de sinalização para a investigação funcional da sonorênese do mouse.

Abstract

A segmentação periódica do mesoderme presomático de um embrião de camundongo em desenvolvimento é controlada por uma rede de vias de sinalização. Acredita-se que oscilações e gradientes de sinalização controlem o tempo e o espaçamento da formação do segmento, respectivamente. Embora as vias de sinalização envolvidas tenham sido estudadas extensivamente ao longo das últimas décadas, faltam evidências diretas para a função de sinalizar oscilações no controle da sonolosegênese. Para permitir a investigação funcional da dinâmica de sinalização, a microfluidics é uma ferramenta previamente estabelecida para a modulação sutil dessas dinâmicas. Com esta abordagem de entranão baseada em microfluidos, as oscilações de sinalização endógenas são sincronizadas por pulsos de moduladores de via. Isso permite a modulação, por exemplo, do período de oscilação ou da relação de fase entre duas vias oscilantes. Além disso, gradientes espaciais de moduladores de via podem ser estabelecidos ao longo do tecido para estudar como mudanças específicas nos gradientes de sinalização afetam a somitogênese.

O presente protocolo visa ajudar a estabelecer abordagens microfluídicas para os usuários iniciantes de microfluidos. Os princípios e equipamentos básicos necessários para configurar um sistema microfluido são descritos, e um design de chip é fornecido, com o qual um molde para geração de chips pode ser convenientemente preparado usando uma impressora 3D. Finalmente, como cultivar o tecido primário do rato em um chip microfluido e como entrar sinalizando oscilações para pulsos externos de moduladores de vias são discutidos.

Este sistema microfluido também pode ser adaptado para abrigar outros sistemas de modelos in vivo e in vitro , como gastruloides e organoides para investigação funcional de dinâmicas de sinalização e gradientes de morfógen em outros contextos.

Introduction

O desenvolvimento é controlado pela comunicação intercelular através de vias de sinalização. Há apenas um número limitado de vias de sinalização que orquestram a formação complexa de tecidos e a diferenciação celular adequada no espaço e no tempo. Para regular essa infinidade de processos, as informações podem ser codificadas na dinâmica de uma via de sinalização, na mudança de uma via ao longo do tempo, como a frequência ou duração de um sinal1,2.

Durante a somitogênese, o tecido somiético é periodicamente segmentado a partir do mesoderme presomático (PSM)3. O PSM é organizado espacialmente por gradientes de Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) e sinalização de ácido retinóico. No PSM anterior na frente de determinação, onde os sinais Wnt e FGF são baixos, as células são preparadas para diferenciação em somitas. A diferenciação ocorre quando uma onda de ativação transcricional atinge essa frente de determinação. Dentro da sinalização PSM, Wnt, FGF e Notch oscilam. As células vizinhas oscilam ligeiramente fora de fase, o que resulta em ondas de ativação transcricional oscilatória a jusante das vias Wnt, FGF e Notch viajando de PSM posterior para anterior. Em embriões de camundongos, uma onda transcricional atinge a frente de determinação aproximadamente a cada 2 h e inicia a formação de somite. Estudar a somitogênese por perturbação ou ativação de vias de sinalização pode ilustrar a importância dessas vias4,5,6,7,8,9. No entanto, para ser capaz de investigar a função da dinâmica de sinalização no controle do comportamento celular, é essencial modular sutilmente as vias de sinalização em vez de ativá-las permanentemente ou inibi-las.

Para modular temporalmente a atividade da via de sinalização dentro do embrião segmentante do rato, Sonnen et al. desenvolveram um sistema microfluido10. Este sistema permite o controle rigoroso dos fluxos de fluidos dentro de microcanais de um chip que contém a amostra biológica11. Para estudar a importância da dinâmica de sinalização para a segmentação adequada do PSM, essa configuração de microfluidos é utilizada para modular a dinâmica de sinalização do relógio de segmentação do mouse ex vivo. Ao pulsar sequencialmente ativadores de vias ou inibidores na câmara de cultura, o controle externo da dinâmica da sinalização Wnt, FGF e Notch é alcançado10. Por exemplo, é possível modificar o período de caminhos individuais e a relação de fase entre múltiplas vias de sinalização oscilatória. Utilizando imagens concomitantes em tempo real de repórteres de sinalização dinâmica, o efeito da entrada nas próprias vias, na diferenciação e na formação de somite pode ser analisado. Utilizando-se esse nível de controle sobre a dinâmica de sinalização, destacou-se a importância da relação de fase entre as vias de sinalização WNT e Notch durante a somitogênese10.

Os designs personalizados de chips permitem uma infinidade de opções para perturbações espessórias no ambiente local, por exemplo, formação estável de gradientes12,13,14,15, ativação/inibição pulsante10,16,17,18 ou perturbações localizadas19,20 . Os microfluidos também podem permitir uma leitura mais reprodutível e maior rendimento devido à automação do manuseio experimental21,22,23. O presente protocolo destina-se a levar microfluidos e entranagem de oscilações de sinalização endógena dentro dos tecidos para todos os laboratórios de ciências da vida padrão. Mesmo na ausência de equipamentos sofisticados para geração de chips, como sala limpa e equipamentos para litografia macia, chips microfluídicos podem ser fabricados e usados para responder a questões biológicas. Os moldes podem ser projetados usando o software CAD (Computer-aided Design, design auxiliado por computador) livremente disponível. Um molde para a geração de chips microfluidos, geralmente constituídos por polidimtilsiloxano (PDMS), pode ser impresso com uma impressora 3D, ou ser encomendado de empresas de impressão. Dessa forma, os chips microfluidos podem ser produzidos dentro de um dia sem a necessidade de equipamentos caros24. Aqui, é fornecido um design de chip, com o qual um molde para a entrada do relógio de segmentação do mouse em culturas ex vivo bidimensionais (2D) 25 pode ser impresso com uma impressora 3D.

Culturas on-chip e perturbações precisas, habilitadas por microfluidos, têm um potencial notável em desvendar os mecanismos moleculares de como as vias de sinalização controlam o comportamento multicelular. A dinâmica de sinalização e gradientes de morfógenos são necessários para muitos processos em desenvolvimento. Anteriormente, os laboratórios tinham células cultivadas, tecidos e organismos inteiros em chips microfluidos e protocolos para perturbação espostecular da cultura celular 2D são fornecidos em outros lugares12,26,27,28,29. A aplicação de microfluidos para modular ambientes locais em sistemas multicelulares abre novas perspectivas para perturbações espórias de alta produtividade e precisas. O campo dos microfluidos chegou agora a um ponto em que se tornou uma ferramenta não especializada, barata e facilmente aplicável para biólogos do desenvolvimento.

Aqui, é fornecido um protocolo para a entrada do relógio de segmentação do mouse aos pulsos de um inibidor de sinalização notch. Tal experimento consiste nas seguintes etapas: (1) geração de chip microfluido, (2) preparação de tubos e revestimento do chip, e (3) o experimento microfluido em si (Figura 1A). Pesquisas envolvendo sistemas de modelos vertebrados exigem aprovação ética prévia do comitê responsável.

Protocol

A pesquisa aqui apresentada foi aprovada pelo comitê de ética da EMBL10 e pelo comitê holandês de pesquisa animal (dierenexperimentencommissie, DEC), e segue as diretrizes de Hubrecht para cuidados com animais. Use luvas enquanto trabalha com PDMS líquido. Cubra superfícies e equipamentos. Remova qualquer derramamento imediatamente, pois a limpeza se torna difícil quando endurece. 1. Geração do chip NOTA: Os chips microfluidos são gerados pela fundição de PDMS (Polydimethylsiloxane) em um molde. Os moldes podem ser projetados usando software CAD (por exemplo, uFlow ou 3DμF30). Um repositório de designs gratuitos é fornecido pelo MIT (Metafluidics.org). Os moldes são impressos com uma impressora 3D ou podem ser gerados por litografia macia usando uma máscara de fotomasca que contém o design desejado (para mais informações, consulte, por exemplo, Qin et al., 201031). Aqui, é fornecido um design para um molde que pode ser impresso com uma impressora 3D para a cultura on-chip do tecido embrionário do rato (Figura 1B,C, Arquivos Suplementares 1 e 2). Para permitir a impressão com impressoras 3D de menor resolução, o design foi modificado em comparação com o publicado anteriormente 10. Um molde sem armadilhas de bolhas de ar e outro com armadilhas de bolhas de ar é fornecido (Arquivos Suplementares 1 e 2, respectivamente). Como o procedimento de impressão depende da impressora disponível, os detalhes para impressão não serão descritos. No entanto, deve-se certificar-se de que toda a resina não polimerizada seja totalmente removida. Muitas vezes é necessário realizar lavagem extra com solventes para remover resina não polimerizada dos pequenos orifícios de < 200 μm dentro da câmara microfluidica. Esses buracos formarão pilares PDMS para prender o tecido embrionário dentro do chip durante o experimento. O PDMS é geralmente usado para microfluidos, pois é barato, biocompatível e transparente, e tem baixa autofluorescência. Após a cura, o chip PDMS é cortado do molde e ligado a uma lâmina de vidro. O tratamento plasmá plasma do vidro e do chip PDMS ativa as superfícies e permite a formação de ligações covalentes, quando colocado em contato. Prepare a quantidade necessária de PDMS misturando o monômero com o catalisador em uma razão de 9:1 (w:w) para induzir a polimerização. Use ferramentas descartáveis para misturar, como copos de plástico e garfos. Certifique-se de que a mistura está devidamente alcançada. Coloque a mistura de PDMS em um dessecador e aplique vácuo por aproximadamente 30 minutos para remover o ar da mistura PDMS. Devido ao vácuo dentro do dessecator, o ar será removido da mistura PDMS.NOTA: Cubra o interior do dessecador com tecidos caso o PDMS flua. Despeje a mistura de PDMS no molde do chip (uma camada PDMS de aproximadamente 3-5 mm é suficiente). Coloque o molde preenchido com PDMS de volta no desiccador e aplique vácuo para remover quaisquer bolhas restantes. Certifique-se de que o ar seja removido de todas as estruturas menores do molde. Cure o molde colocando-o em um forno de 65 °C (ou inferior, dependendo do material do molde) durante a noite. Corte o chip do molde usando um bisturi. Corte o PDMS endurecido do molde com espaço suficiente (1-2 cm) ao redor do design para permitir a ligação posterior. Certifique-se de cortar completamente o PDMS para evitar a quebra do chip ao tirá-lo. Levante o chip PDMS com cuidado, primeiro com a extremidade contundente do bisturi e, quando possível, com as mãos. Furar os orifícios de entrada e saída, começando pelo interior da câmara microfluidic usando um soco de biópsia de 1 mm. Limpe o chip PDMS brevemente com ar comprimido e coloque fita adesiva em ambos os lados para remover quaisquer pedaços presos de PDMS e poeira e mantê-lo limpo até que use mais.NOTA: O chip pode ser mantido assim até uso posterior. Limpe o deslizamento de vidro com ar comprimido. Tenha cuidado para que não quebre. Remova a fita adesiva do chip PDMS. Conecte o chip ao escorregador de vidro usando um forno de plasma. As seguintes instruções são otimizadas para plasma de ar.NOTA: Consulte o manual do forno de plasma do laboratório e otimize o procedimento para o experimento específico. Coloque o chip e o deslizamento de vidro no forno de plasma com as laterais a serem ligadas de frente para cima. Coloque a tampa sobre o forno de plasma e mantenha-a no lugar enquanto aplica o vácuo e espere até que o vácuo se estabelece. Ligue o gás pressionando o botão Gás e espere aproximadamente 1 min (a pressão deve ficar em torno de 0,37 mbar). Gerar plasma pressionando gerador (Potência: 9.0, Tempo: 1 min). Quando terminar, desligue a bomba e o gás; ventilar e abrir a porta. Conecte o chip ao vidro colocando as superfícies ativadas umas nas outras e aplicando pressão uniformemente. Tenha cuidado para que o vidro não quebre.NOTA: Um teste de água pode ser realizado para confirmar que o tratamento plasmá-lo funcionou. Coloque uma gota de água na superfície do vidro. Se o tratamento plasmético funcionou, a água deve se espalhar imediatamente em vez de formar uma gota. Coloque o chip ligado em um forno a 65 °C por 5 minutos. Sele o lado exposto do chip com fita adesiva para evitar que a poeira entre nas entradas.NOTA: O chip pode ser mantido até o uso. As aberturas devem ser fechadas com fita até lá. 2. Preparando o experimento de microfluidos NOTA: As seguintes etapas preparatórias são necessárias para realizar o experimento dos microfluidos: Primeiro, ao realizar o experimento dos microfluidos, cria-se um fluxo de fluidos a partir das entradas para as tomadas. Quaisquer furos no chip funcionarão como tomadas devido ao acúmulo de pressão das entradas. Portanto, todos os orifícios que não são utilizados devem ser fechados; por exemplo, orifícios que são usados para carregar tecido no chip. Se estes não estiverem fechados, o tecido pode fluir com o fluido. Para fechar esses orifícios, é utilizada tubulação cheia de PDMS. A tubulação cheia de PDMS pode ser mantida indefinidamente e, portanto, não precisará estar preparada para cada experimento de microfluidos separadamente, mas pode ser feita em lotes maiores. Em segundo lugar, antes do início do experimento microfluido, tubos, tubos cheios de PDMS, e o chip, necessário para o experimento, são preparados e esterilizados por UV. Finalmente, o chip tem que ser revestido com fibronectina, para que o tecido embrionário possa se prender ao vidro25. Fazendo tubos cheios de PDMS. Pegue ± 1 m de tubulação. Mais tubos podem ser preenchidos com PDMS, pegando vários pedaços de tubulação. Prepare a quantidade necessária de PDMS misturando o monômero com o catalisador em uma razão de 9:1 (w:w) para induzir a polimerização.NOTA: Use ferramentas descartáveis para misturar, como copos plásticos e garfos. Misture corretamente. Coloque a mistura de PDMS em um dessecador e aplique vácuo por aproximadamente 30 minutos para remover o ar da mistura PDMS.NOTA: Cubra o interior do dessecador com tecidos caso o PDMS flua. Encha uma seringa de 3 mL com PDMS. Encha cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar na mistura. Use fórceps para inserir a ponta de uma agulha de 22 G na tubulação.NOTA: Tenha cuidado para não perfurar o tubo ou os dedos com a agulha. Conecte a tubulação à seringa cheia de PDMS através da agulha. Use a bomba de seringa para encher o tubo, com uma vazão de aproximadamente 500 μL/h. Tenha cuidado para não aplicar pressão muito alta para evitar a quebra da bomba. Uma vez que a tubulação esteja inteiramente cheia de PDMS, coloque-a em um prato de 15 cm e cure à temperatura ambiente (pelo menos durante a noite). Prepare a tubulação e o chip para o experimento.NOTA: O seguinte tubo é necessário para o experimento: primeiro, aproximadamente 50 cm de tubulação por tomada e segundo, aproximadamente 2-3 m por entrada (o tamanho exato depende da organização espacial das bombas, incubadora ou microscópio usados posteriormente). A tubulação de entrada precisa ser longa para permitir que o meio cultural se equilibre com CO2 para a cultura de embriões durante o experimento. Corte a tubulação em um ângulo de 45° para que as extremidades pontiagudas sejam criadas; isso facilitará a inserção da tubulação nos orifícios do chip. Coloque uma agulha em cada um dos tubos de entrada. Veja o passo 2.1.5. Corte a tubulação cheia de PDMS em plugues de ± 1 cm. Corte em um ângulo de 45° para que as extremidades pontiagudas sejam criadas; isso facilitará a inserção da tubulação nos orifícios do chip. São necessários plugues suficientes para preencher cada orifício que não esteja anexado a nenhuma tubulação. Remova a fita adesiva do chip. Coloque toda a tubulação com agulhas presas, o chip e os plugues em um prato e esterilize expondo à luz UV por ±15 min. Qualquer capa de cultura celular com possibilidade de esterilização UV pode ser usada. Revestimento de chip com fibronectina.NOTA: Para a cultura 2D ex vivo culturas de PSM posterior, cubra o chip com fibronectina. Coloque o chip em um béquer contendo PBS + 1% Penicilina/Estreptomicina à temperatura ambiente. Certifique-se de que o chip está completamente coberto com PBS. Lave o chip com PBS para remover ar com uma pipeta P200.NOTA: Todo o manuseio adicional do chip será feito neste béquer até o início do experimento para evitar a entrada de ar no chip. Tenha cuidado para não quebrar o deslizamento de vidro do chip. Prepare 2 mL de 1:20 Fibronectin em PBS e preencha em um béquer. Carregue uma seringa de 3 mL para cada câmara do chip. Com fórceps, insira uma agulha de 22 G na tubulação de saída. Coloque a agulha na seringa contendo fibronectina. Conecte a seringa à bomba de seringa. Lave a tubulação, até que não haja mais ar na tubulação. Conecte a tubulação de saída à saída do chip. Certifique-se de empurrar a tubulação todo o caminho até o fundo. Defina uma baixa taxa de fluxo para revestir o chip. Todas as outras vagas podem permanecer abertas. Deixe a bomba de seringa funcionar por pelo menos 2 h, também pode funcionar durante a noite. Pare a bomba. Corte a tubulação logo após a agulha. O tubo restante servirá como saída durante o experimento mais tarde. 3. Experimento de microfluidos NOTA: Aqui, é apresentado um protocolo para a entrada do relógio de segmentação do mouse em culturas ex vivo 2D, aplicando pulsos do inibidor de sinalização notch DAPT. A aplicação de pulsos com um período de 130 minutos, próximo ao período natural do relógio de segmentação do mouse (137 min25), permite uma entrada eficiente. São aplicados pulsos de 100 min de médio e 30 min de 2 μM DAPT (Figura 2A). A presença de droga dentro do chip é monitorada usando um corante fluorescente. Os espectros de excitação e emissão deste corante e do repórter de sinalização fluorescente devem ser diferentes o suficiente para evitar sangramento durante a fluorescência em tempo real de imagem. Quando proteínas fluorescentes amarelas são usadas como repórter de sinalização, como o repórter de sinalização Notch LuVeLu5 (franja lunática-Venus-Lunática), o corante, Cascade Blue, pode ser aplicado. Para identificar outras possíveis combinações de corante fluorescente e repórter, o visualizador de espectros livremente disponível pode ser usado. O efeito da entranção pode ser detectado por imagens em tempo real de repórteres de sinalização dinâmica5,10,32. Cada chip tem duas câmaras de incubação. Isso permite a comparação direta dos pulsos de drogas (DAPT) para controlar pulsos (DMSO). Faça degas médias e degas. No dia do experimento, prepare 50 mL de cultura média (DMEM-F12 complementado com 0,5 mM de glicose, 2 mM de glutamina e 1% BSA, para mais informações sobre a cultura do rato tailbud ver25). Prepare seringas cheias com o meio para o experimento. Prepare o meio de cultura em béquers: Para entrar As oscilações de sinalização notch, prepare 6 mL de médio com 1,2 μL de DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 mL de meio de cultura com 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Azul; dois tubos com 6 mL de médio cada. Use pelo menos 6 mL de médio por seringa. Carregue seringas com o meio. Certifique-se de rotular as seringas que contêm droga e DMSO. Desgas o chip dentro da PBS e as seringas contendo meio em um dessecador. Coloque as seringas em um béquer com a ponta virada para cima, para que o ar possa escapar no topo. Pode ocorrer que o chip flutua e ainda está cheio de bolhas. Estes serão removidos posteriormente. Tente lavar/sugar a maioria das bolhas de ar do chip usando uma pipeta P200. Se algum ar permanecer, isso será removido durante o seguinte experimento. Instale seringas nas bombas e conecte tubos de entrada às seringas. Para entrar na sinalização notch, use duas bombas de seringa, uma carregando as seringas médias, uma carregando as seringas de droga/DMSO. Deixe isso funcionar a uma taxa de fluxo mais alta (0,5 mL/h) até o início do experimento para remover bolhas de ar da tubulação. Tenha cuidado para definir os detalhes da seringa (diâmetro) corretamente na bomba. Carregando tecido no chip. Dissecar tecido embrião de rato. Disseque a ponta mais posterior da cauda (tailbud). Coloque o tecido dissecado em meio de cultura + 25 μM HEPES. Lave o chip com meio de cultura + 25 μM HEPES usando um P200 para remover PBS. Carregue o tecido no chip usando uma pipeta P200 (Figura 1C). Certifique-se de não introduzir bolhas de ar no chip.NOTA: O carregamento eficiente requer alguma prática. Se o tecido não for orientado corretamente, pode ser possível transformá-lo sugando-o cuidadosamente e lavando-o novamente. No entanto, isso muitas vezes resulta em morte celular rápida. Após cada etapa de carregamento de tecido, feche a entrada correspondente de carga tecidual usando um pedaço de tubulação cheia de PDMS. Certifique-se de que os plugues estão suficientemente empurrados para baixo para a parte inferior do chip usando pinças sem corte. Depois de todas as amostras terem sido carregadas, feche quaisquer entradas/tomadas nãousadas com pedaços de tubos cheios de PDMS usando fórceps sem cortes. Montagem da configuração microfluidica. Reduza a vazão das bombas microfluídicas. 60-100 μL/h funciona bem para os tailbuds de embrião do rato. Em taxas de fluxo mais elevadas, observou-se morte celular – presumivelmente devido a uma cisalhamento celular muito alto. A taxa de fluxo cumulativa de várias bombas não deve exceder estas 60-100 μL/h por câmara microfluidica em um determinado momento. Anexar tubos ao chip microfluido. Faça isso sem obter bolhas de ar dentro do chip (isso pode ser alcançado garantindo que haja uma gota de meio presente no final da tubulação). As tomadas ainda estão presentes a partir do revestimento de fibronectina (ver 2.3). Uma vez que toda a tubulação esteja presa ao chip, tire-o do béquer, seque-o corretamente, coloque-o em um prato, e coloque-o junto com aproximadamente 1,5 m de tubo de entrada em uma incubadora (37 °C, 20% O2, 5% CO2) para a cultura da noite para o dia. A tubulação é permeável a gás; isso permitirá o equilíbrio de O2 e CO2 no meio. Alternativamente, para imagens simultâneas de fluorescência em tempo real, o chip e aproximadamente 1,5 m de tubos de entrada são colocados diretamente no microscópio. Um suporte para o chip, que se encaixa nos porta-placas padrão de 96 poços, é fornecido no Arquivo Suplementar 3.NOTA: Certifique-se de que a umidade esteja alta o suficiente durante a incubação. Se necessário, adicione um tecido úmido à câmara de imagem ou incubadora para evitar a evaporação na configuração dos microfluidos. Se a umidade na incubadora do microscópio é muito baixa, isso resulta na formação de bolhas de ar no tubo e no chip microfluido. Uma caixa de imagem fechada, na qual chip e tubo são colocados, pode então ser usada. A maneira mais simples de fazer tal caixa de imagem é colocando uma tampa grande sobre o chip e adicionando um tecido molhado, ele não precisa ser totalmente fechado. Certifique-se de que a diferença de altura entre bomba e chip não é muito grande e, se necessário, mude de altura lentamente para evitar a formação de bolhas de ar devido à gravidade. Deixe todas as bombas fluírem a uma vazão de 20 μL/h por 20 minutos, depois que a configuração tiver sido colocada em sua localização final. Como a câmara e a bomba provavelmente se moveram em altura, isso é necessário para restabelecer a pressão correta na tubulação. Desligue a bomba de droga, deixe apenas a bomba média funcionar a 60 μL/h até o início da experiência/imagem em tempo real. Início do experimento. Inicie o programa de bombeamento planejado para o experimento. Para entrar na sinalização notch, use um programa de bombeamento de 100 min médios e 30 min de pulsos de droga, que é repetido até o final do experimento, normalmente por 24 horas.NOTA: Qualquer bomba microfluidica programável pode ser usada. No formato mais simples, as bombas podem ser programadas e iniciadas manualmente. Alternativamente, as bombas podem ser controladas por um software de computador. Caso seja realizada a imagem em tempo real, inicie a imagem após um período de pelo menos 30 minutos. Isso permitirá que a temperatura do chip se ajuste à temperatura dentro da incubadora e evite uma deriva muito forte durante a imagem. O foco automático ainda é benéfico. Realize imagens confocal padrão através do slide de vidro do chip usando um microscópio invertido. Use um intervalo de imagem de 10 minutos para detectar suficientemente oscilações de sinalização com um período de 130 min. Por períodos mais curtos, encurte o intervalo para amostragem suficiente. Inclua uma faixa de imagem de baixa resolução para detecção de Cascade Blue para visualizar a presença de droga no chip. Para excitação de um repórter de Vênus, use um laser de 515 nm ou um laser de 2 fótons a um comprimento de onda de 960 nm. Adquira uma pilha z de 6-8 planos com uma distância de 8 μm através de um objetivo de plano de 20x (resolução 512 x 512 pixels, 1,38 μm/pixel). Use um estágio motorizado para visualizar várias amostras dentro de um experimento. Excite Cascade Blue com um laser de 405 nm e adquira um único plano z a cada 10 min (resolução 32 x 32 pixels, 22,14 μm/pixel).NOTA: Mais informações sobre imagem e análise de imagens são fornecidas nos Resultados Representativos e podem ser encontradas em referência10.

Representative Results

Com este protocolo, é apresentado um método para a entrada externa de oscilações de sinalização do relógio de segmentação do mouse utilizando microfluidos. Aplicando pulsos do inibidor de sinalização notch, oscilações de sinalização em culturas independentes de embriões são sincronizadas entre si10. Um pré-requisito para a aplicação deste sistema para estudar a funcionalidade do relógio de segmentação é que a dinâmica de sinalização e segmentação ainda estão presentes no chip. Foi demonstrado anteriormente que tanto a dinâmica de sinalização WNT quanto a Notch são mantidas, apesar do fluxo médio constante e a formação de limites físicos persiste em culturas 2D periféricas, representando o PSM10 anterior. Para confirmar a entrada de oscilações de sinalização para pulsos de drogas externas, imagens em tempo real de, por exemplo, o repórter de sinalização Notch LuVeLu5, expressando a proteína fluorescente amarela Vênus, durante o experimento microfluido é realizado. Uma vez que a orientação das culturas 2D no chip é difícil de controlar, as oscilações de sinalização no tecido anterior são analisadas. A periferia da cultura 2D pode ser detectada de forma reprodutificavelmente. A orientação das seções teciduais no chip não pode ser controlada à vontade e toda a superfície interna do chip é revestida com Fibronectina. Portanto, ocasionalmente acontece que as culturas se prendem às laterais ou ao teto do chip. No caso de as amostras saírem do campo de visão (na direção x, y e z) ou se anexarem à extremidade posterior da cauda voltada para baixo, geralmente essas amostras são excluídas. Para análise mais aprofundada, vários desses experimentos de entramento são combinados. Experimentos independentes podem ser alinhados uns aos outros usando o tempo dos pulsos de droga visualizados pelo corante, Cascade Blue, a aproximadamente 400 nm. Para analisar e visualizar a sincronização, podem ser calculadas oscilações quantificadas (Figura 2B,D) e, em seguida, exibidas como desvio médio e padrão ou fases das oscilações. Isso permite a análise da relação de fase entre oscilações de culturas independentes de embriões posteriores entre si e os pulsos externos de drogas (Figura 2C,E). O programa baseado em píton pyBOAT33 é uma ferramenta simples e fácil de usar para determinar período, fase e amplitude de tais oscilações de sinalização. Para confirmar a entranção, pode-se, por exemplo, determinar o período das oscilações de sinalização endógenas. Ao aplicar pulsos com um período de 130 minutos, as oscilações de sinalização notch também mostram um período de 130 min (Figura 2F)10. Além disso, usando pulsos Cascata Azul, experimentos independentes com diferentes repórteres de sinalização podem ser alinhados entre si. Dessa forma, a relação de fase entre oscilações de repórteres de sinalização múltipla pode ser indiretamente determinada10. Assim, o sistema microfluido apresentado permite o controle de oscilações de sinalização nas culturas ex vivo do embrião do camundongo em desenvolvimento. Em combinação com imagens de marcadores para formação e diferenciação de segmento, este sistema agora pode ser aplicado para dissecar como as vias de sinalização do relógio de segmentação interagem e como controlam a formação de somite. Figura 1: Visão geral esquemática do protocolo de microfluidos. (A) Os moldes de chip podem ser projetados usando o software CAD (Computer-aided-Design, design auxiliado por computador). Um design de chip para entrar oscilações de sinalização em modelos ex vivo de somitogênese do mouse é fornecido. Moldes podem, por exemplo, ser gerados por impressão 3D ou encomendados. Os chips microfluidos são produzidos por moldagem de PDMS. Um chip PDMS endurecido é cortado e covalentemente ligado a um slide de vidro usando um forno de plasma. A superfície de vidro dentro do chip é revestida com fibronectina para permitir que o tecido dissecado se conecte. O tecido embrionário é carregado no chip através de entradas de carregamento, que são posteriormente fechadas. Bombas com diferentes condições de mídia são anexadas às entradas do chip e um programa de fluxo é iniciado. O tecido pode ser imageado usando um microscópio confocal durante o experimento. (Kymographs adaptados de Sonnen et al., 201810. Reimpresso e modificado da Cell de acordo com Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Desenho esquemático de um desenho de molde para a cultura on-chip do tecido embrião posterior do rato. A altura dos canais microfluidos é de 500 μm, suficiente para a cultura das caudas posteriores do rato embrionário. O arquivo para imprimir este molde é fornecido no Arquivo Suplementar 1, e uma alternativa é dada no Arquivo Suplementar 2. (C) Imagem brightfield de uma cauda de rato seccionada E10.5 incluída por pilares PDMS no chip. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Resultados representativos de um experimento de microfluidos. (A) Representação esquemática do experimento de entramento com bomba média e medicamentosa. Pulsos de modulador de via de sinalização são aplicados a culturas ex vivo de embriões de camundongos e oscilações de sinalização podem ser visualizadas por imagens em tempo real de repórteres de sinalização dinâmica (por exemplo, o repórter de sinalização Notch LuVeLu5 e Wnt sinalizando repórter Axin2T2A10). As linhas tracejadas indicam a região que é usada para análises ao longo do tempo. (B-F) As oscilações dos repórteres luVeLu são entranadas por pulsos periódicos do inibidor de sinalização Notch DAPT. (B,D) Quantificações de oscilações de sinalização notch no PSM anterior após a entrada usando dapt ou um controle DMSO. (C,E) Gráficos de relação fase entre a fase de oscilações de sinalização de Notch e o tempo dos pulsos externos DAPT/DMSO. Em caso de entranão, estabelece-se uma relação de fase estável. (F) Quantificação do período médio e SEM das oscilações dos repórteres comparando amostras entrelgadas com pulsos DMSO e DAPT. (Figura adaptada de Sonnenet al., 201810. Reimpresso e modificado da Cell de acordo com Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Problema Soluções sugeridas(s) O PDMS não se liga ao vidro. – Certifique-se de que tanto o PDMS quanto o vidro estão limpos. – Certifique-se de que há PDMS suficientes ao redor da câmara para a ligação. – Otimizar as configurações do forno de plasma. Há bolhas de ar no meu chip. Verifique se a bomba estava ligada. – Desgas o chip antes de carregar tecido no chip. – Degas o meio antes do início do experimento. – Certifique-se de que a umidade na câmara de incubação é alta o suficiente. O tecido morre no início do experimento. – Adicione HEPES ao meio ao carregar e montar o chip. – Não coloque o tecido para dentro e para fora com muita frequência durante o carregamento. – Verifique se a vazão não é muito alta. O tecido morre durante a imagem. – Certifique-se de que não há fototoxicidade da imagem – Certifique-se de que não há contaminação. – A vazão não deve ser muito alta. O foco muda durante a imagem. – Use foco automático durante a imagem para ajustar para deriva do slide de imagem. – Deixe o chip equilibrar até a temperatura dentro do microscópio por pelo menos 30 minutos. Saídas/entradas se destacam. – Empurre todos os tubos completamente para baixo até o fundo. O vidro do chip quebra. – Tenha mais cuidado, o vidro é muito frágil. – O vidro fino só é necessário para a imagem. Se a imagem não for realizada, uma lâmina de vidro mais espessa pode ser usada. – Se a ruptura estiver fora do chip, pode não ser um problema. Se o selo de vidro do chip estiver quebrado, o líquido vazará e o ar entrará. Há uma contaminação no meu chip. – Adicione antibióticos ao meio da cultura. – Esterilizar todos os equipamentos e tubos. – Trabalhe rápido e limpo. Tabela 1: Solução de problemas Arquivo complementar 1: Arquivo STL para imprimir um molde com uma impressora 3D. Este molde é usado para gerar um chip microfluido para a cultura on-chip de tecido embrionário posterior (design mostrado na Figura 1). Clique aqui para baixar este Arquivo. Arquivo complementar 2: Arquivo STL para impressão de um molde com uma impressora 3D para gerar um chip microfluidic para a cultura on-chip de tecido embrionário posterior. Em contraste com o Arquivo Suplementar 1 e o design mostrado na Figura 1, este projeto contém armadilhas de bolhas em todas as entradas para evitar que pequenas quantidades de ar entrem na câmara microfluidica principal. Clique aqui para baixar este Arquivo. Arquivo complementar 3: Arquivo de design para a geração de um suporte para colocar o chip no microscópio. Este suporte tem as dimensões de uma placa de 96 poços e deve caber nos suportes padrão da maioria dos microscópios. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussion

Como a dinâmica de sinalização controla sistemas multicelulares tem sido uma questão de longa data no campo. A investigação funcional representa um desafio fundamental, pois essas dinâmicas devem ser sutilmente moduladas para permitir isso11. Esse controle temporal sobre perturbações de caminhos pode, em princípio, ser alcançado com a optogenética, que também permite um alto controle espacial34. No entanto, a optogenética requer o estabelecimento de ferramentas genéticas sofisticadas para a análise de cada via de sinalização em questão. O protocolo atual descrito aqui fornece uma ferramenta altamente versátil para a perturbação de qualquer via de sinalização. O experimento de microfluidos permite a aplicação de pulsos de drogas controlados temporalmente para investigar funcionalmente a dinâmica das vias de sinalização nas culturas teciduais. Aqui, o foco está no estudo da somitogênese nas culturas ex vivo , mas o protocolo pode ser adaptado para se adequar a qualquer outro modelo de sistemas.

Certas etapas do protocolo são fundamentais para realizar um experimento de microfluidos bem sucedido (resumido na Tabela 1). Pontos-chave são discutidos da seguinte forma. Devido ao fluxo médio durante o experimento, a cultura tecidual experimenta o estresse de cisalhamento. A exposição do sistema modelo ao fluxo contínuo pode causar estresse celular e, em casos extremos, a morte celular devido ao efeito de cisalhamento. Para as culturas de tecido ex vivo dos tailbuds do mouse e o design atual do chip, foi encontrada uma taxa de fluxo de 60 μL/h (máximo de 100 μL/h) para funcionar bem com efeito de cisalhamento mínimo. Quando várias bombas são ligadas simultaneamente para o mesmo chip, a taxa de fluxo das bombas individuais precisa ser ajustada de acordo para não causar um aumento na taxa de fluxo total. Quando o protocolo atual é adaptado a outros sistemas de modelos e projetos de chips, a taxa de fluxo deve ser otimizada. Alternativamente, é possível não lavar o meio continuamente, mas mudar periodicamente o meio no chip35. Tal configuração também pode ser aplicada para controlar oscilações de sinalização na somitogênese do mouse (dados não mostrados, não mostrados). Além disso, também pode ser imaginada uma configuração, na qual as culturas teciduais não são expostas ao fluxo direto de fluidos, mas as drogas chegam ao tecido por difusão de um canal vizinho. Tais sistemas têm sido utilizados com sucesso para aplicar gradientes de fatores de crescimento a modelos in vitro de diferenciação ESC14,36.

Uma grande questão dos experimentos microfluidos é a ocorrência de bolhas de ar no chip durante o experimento. Bolhas de ar dentro do chip ou tubo podem interferir com o fluxo líquido uniforme no chip e podem levar à remoção da cultura embrionária de sua localização. Para evitar a presença de bolhas de ar, várias etapas do protocolo são indispensáveis. Em primeiro lugar, o meio de cultura dentro das seringas e o chip microfluido em si deve ser desgassed usando um dessecador (passo 3.1.3). Em segundo lugar, ao carregar amostras nas entradas de carregamento, deve-se ter cuidado para não colocar o ar no chip junto com a amostra (etapa 3.2.3). Em terceiro lugar, ao encher a tubulação com médio, todas as bolhas de ar devem ser bombeadas antes de anexar o chip (etapa 3.3.2). Caso contrário, essas bolhas serão empurradas para dentro do chip principal durante o experimento. Por fim, durante o experimento, o meio é equilibrado dentro da câmara de imagem ou incubadora devido à tubulação semi-permeável. A permeabilidade do tubo também permite a evaporação do meio, por isso certifique-se de que a umidade seja regulada durante o experimento para evitar a formação de novas bolhas na tubulação.

Em geral, a microfluidics é uma ferramenta altamente versátil que pode ser adaptada à questão específica do pesquisador. A abordagem de design atual permite imagens de até 12 culturas ex vivo em paralelo por chip. Este número é limitado principalmente pelo número de embriões por experimento e pelo tempo que leva para imaginar cada cultura de embrião com resolução suficiente. Se várias condições precisarem ser comparadas em um único experimento, vários chips podem ser montados em um único slide de vidro. É fornecido um design de chip, ideal para imagens de múltiplas explicações teciduais em paralelo, mas projetos personalizados podem superar limitações no número de amostra para permitir análises de alto rendimento e aumentar a combinação de mais condições dentro de um único experimento16,17. Os microfluidos se limitam a modelos que podem ser cultivados em um chip e a cultura on-chip terá que ser otimizada para cada sistema modelo individualmente27,37,38.

Nos últimos 5 a 10 anos, microfluidos têm sido aplicados para abordar várias questões biológicas devido ao seu potencial de abordagens de alta produtividade e modulações sutis de dinâmica de sinalização e gradientes. Atualmente, os microfluidos tornaram-se uma ferramenta facilmente aplicável, barata e versátil que os laboratórios podem estabelecer com facilidade. Aqui, o protocolo atual é otimizado para uma aplicação específica, ou seja, estudando a dinâmica de sinalização que rege a somitogênese. É simples adaptar este protocolo e design para se adequar a questões individuais de pesquisa em biologia tecidual.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Yang Li e Jos Malda do UMC Utrecht por ajuda com a impressão 3D de moldes, Karen van den Anker do grupo Sonnen por feedback muito útil sobre o protocolo, e Tjeerd Faase da oficina mecânica no Instituto Hubrecht para o suporte de chips microfluídicos dentro do microscópio. Gostaríamos de agradecer a todo o grupo Sonnen pela leitura crítica do manuscrito e dos revisores por seu feedback construtivo. Este trabalho recebeu financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa sob um acordo de concessão inicial da ERC nº 850554 à K.F.S.

Materials

10 mL syringe Becton, Dickinson and company 300912
184 Silicon Elastomer curing agent SYLGARD 1673921
184 Silicon Elastomer PDMS SYLGARD 1673921
3 ml syringes Becton, Dickinson and company 309657
Adhesive tape Scotch Magic tape or similar
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel Fisher Scientific 10663341
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 Biowest P6154
Compressed air system
Crystallizing dish VWR 10754-7 Sterilized
D-(+)-Glucose 45% Sigma G8769
Desiccator VWR 467-0104
Disposable cups Duni 173 941
Disposable forks Staples 511514
Dissection equipment
DMEM/F12 Cell culture technologies custom DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose
Fibronectin Sigma F1141-5MG
Flow hood BioVanguard Greenline CleanAir by Baker 511514 For UV light source
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm Marienfeld 107999098
HEPES Buffer Gibco 15630-056
L-glutamine Gibco 25030024
Microscope Leica Leica SP8 MP
Needles 22G Becton, dickinson and company z412139-100EA
Oven VWR 390-09
PBS0
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Plasma oven Femto Diener electronic
Punch Ø 1mm Uni-Core WB100073
Scale Sartorius Entris
Syringe pump WPI AL-4000
Tubing Ø 1mm APT AWG24T
Vacuum pump VWR 181-0308
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References

  1. Manning, C. S., et al. Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  2. Seymour, P. A., et al. Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors. Developmental Cell. , 1-17 (2020).
  3. Hubaud, A., Pourquié, O. Signaling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  4. Aulehla, A., et al. Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis. Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).
  5. Aulehla, A., et al. A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  6. Niwa, Y., et al. The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock. Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).
  7. Niwa, Y., et al. Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis. Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).
  8. Sonnen, K. F., Aulehla, A. Dynamic signal encoding – From cells to organisms. Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).
  9. Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis. Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).
  10. Sonnen, K. F., et al. Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation. Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).
  11. Sonnen, K. F., Merten, C. A. Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology. Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).
  12. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).
  13. Cimetta, E., et al. Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling. Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).
  14. Demers, C. J., et al. Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device. Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).
  15. Frank, T., Tay, S. Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients. Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).
  16. Tay, S., et al. Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing. Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).
  17. Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  18. Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160 (3), 381-392 (2015).
  19. Takayama, S., et al. Subcellular positioning of small molecules. Nature. 411 (6841), 1016 (2001).
  20. Takayama, S., et al. Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams. Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).
  21. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  22. Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments. Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).
  23. Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
  24. Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia. Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).
  25. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).
  26. Lo, J. F. J., et al. Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).
  27. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  28. Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics. Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).
  29. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. , (2020).
  30. Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. 3DµF – Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
  31. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  32. Yoshioka-kobayashi, K., et al. Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock. Nature. 16, (2019).
  33. Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. Optimal time frequency analysis for biological data – pyBOAT. bioRxiv. , (2020).
  34. Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time. Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
  35. Dettinger, P., et al. Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells. Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).
  36. Manfrin, A., et al. Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).
  37. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 965, 960-965 (2019).
  38. Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements. Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).

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van Oostrom, M. J., Meijer, W. H. M., Sonnen, K. F. A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis. J. Vis. Exp. (169), e62318, doi:10.3791/62318 (2021).
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