Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

La investigación presentada aquí ha sido aprobada por el comité de ética del EMBL10 y el comité holandés para la investigación animal (dierenexperimentencommissie, DEC), y sigue las directrices de Hubrecht para el cuidado de los animales. Use guantes mientras trabaja con PDMS líquido. Cubrir superficies y equipos. Retire cualquier derrame de inmediato, ya que la limpieza se vuelve difícil una vez que se endurece. 1. Generación del chip NOTA: Los chips microfluídicos se generan mediante la fundición de PDMS (polidimetilsiloxano) en un molde. Los moldes se pueden diseñar utilizando software CAD (por ejemplo, uFlow o 3DμF30). Un repositorio de diseños libres es proporcionado por el MIT (Metafluidics.org). Los moldes se imprimen con una impresora 3D o se pueden generar mediante litografía suave utilizando una fotomáscara que contiene el diseño deseado (para obtener más información, consulte, por ejemplo, Qin et al., 201031). Aquí, se proporciona un diseño para un molde que se puede imprimir con una impresora 3D para el cultivo en chip de tejido embrionario de ratón (Figura 1B, C, Archivos complementarios 1 y 2). Para permitir la impresión con impresoras 3D de menor resolución, el diseño se ha modificado en comparación con el publicado anteriormente10. Se proporciona un molde sin trampas de burbujas de aire y uno con trampas de burbujas de aire (Archivos complementarios 1 y 2, respectivamente). Como el procedimiento para imprimir depende de la impresora disponible, no se describirán los detalles para la impresión. Sin embargo, uno debe asegurarse de que toda la resina no polimerizada se elimine por completo. A menudo se requiere realizar un lavado adicional con solventes para eliminar la resina no polimerizada de los pequeños orificios de <200 μm dentro de la cámara microfluídica. Estos agujeros formarán pilares PDMS para atrapar el tejido embrionario dentro del chip durante el experimento. PDMS se usa generalmente para microfluídica, ya que es barato, biocompatible y transparente, y tiene baja autofluorescencia. Después del curado, el chip PDMS se corta del molde y se adhiere a un portaobjetos de vidrio. El tratamiento con plasma tanto del vidrio como del chip PDMS activa las superficies y permite la formación de enlaces covalentes, cuando se ponen en contacto. Prepare la cantidad requerida de PDMS mezclando el monómero con el catalizador en una proporción de 9:1 (w:w) para inducir la polimerización. Use herramientas desechables para mezclar, como vasos de plástico y tenedores. Asegúrese de que la mezcla se logra correctamente. Coloque la mezcla PDMS en un desecador y aplique al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar el aire de la mezcla PDMS. Debido al vacío dentro del desecador, el aire se eliminará de la mezcla PDMS.NOTA: Cubra el interior del desecador con tejidos en caso de que PDMS fluya. Vierta la mezcla pdms en el molde del chip (una capa PDMS de aproximadamente 3-5 mm es suficiente). Coloque el molde lleno de PDMS de nuevo en el desecador y aplique vacío para eliminar las burbujas restantes. Asegúrese de que el aire se elimine de todas las estructuras más pequeñas del molde. Cure el molde colocándolo en un horno de 65 ° C (o menos dependiendo del material del molde) durante la noche. Corta el chip del molde con un bisturí. Corte el PDMS endurecido del molde con suficiente espacio (1-2 cm) alrededor del diseño para permitir una unión posterior. Asegúrese de cortar el PDMS por completo para evitar la rotura del chip al sacarlo. Levante el chip PDMS con cuidado, primero con el extremo romo del bisturí y, cuando sea posible, con las manos. Perforar los orificios de entrada y salida, comenzando desde el interior de la cámara microfluídica utilizando una punción de biopsia de 1 mm. Limpie brevemente el chip PDMS con aire comprimido y cinta adhesiva adhesiva adhesiva en ambos lados para eliminar los trozos atascados de PDMS y polvo y mantenerlo limpio hasta su uso posterior.NOTA: El chip se puede mantener así hasta su uso posterior. Limpie el portaobjetos de vidrio con aire comprimido. Tenga cuidado de que no se rompa. Retire la cinta adhesiva del chip PDMS. Une el chip al portaobjetos de vidrio con un horno de plasma. Las siguientes instrucciones están optimizadas para el plasma de aire.NOTA: Consulte el manual del horno de plasma del laboratorio y optimice el procedimiento para el experimento específico. Coloque el chip y el portaobjetos de vidrio en el horno de plasma con los lados a unir hacia arriba. Coloque la tapa en el horno de plasma y manténgala en su lugar mientras aplica el vacío y espere hasta que se haya establecido el vacío. Encienda el gas presionando el botón Gas y espere aproximadamente 1 minuto (la presión debe estar en alrededor de 0.37 mbar). Generar plasma presionando Generador (Potencia: 9.0, Tiempo: 1 min). Cuando termine, apague la bomba y el gas; ventilar y abrir la puerta. Une el chip al vidrio colocando las superficies activadas unas sobre otras y aplicando presión uniformemente. Tenga cuidado de que el vidrio no se rompa.NOTA: Se puede realizar una prueba de agua para confirmar que el tratamiento con plasma ha funcionado. Coloque una gota de agua sobre la superficie del vidrio. Si el tratamiento con plasma ha funcionado, el agua debe extenderse inmediatamente en lugar de formar una gota. Coloque el chip adherido en un horno a 65 °C durante 5 min. Selle el lado expuesto del chip con cinta adhesiva para evitar que el polvo entre en las entradas.NOTA: El chip se puede conservar hasta su uso. Las aberturas deben cerrarse con cinta adhesiva hasta entonces. 2. Preparación del experimento de microfluídica NOTA: Los siguientes pasos preparatorios son necesarios para realizar el experimento de microfluídica: Primero, al realizar el experimento de microfluídica, se crea un flujo de fluido desde las entradas hasta las salidas. Cualquier agujero en el chip funcionará como salidas debido a la acumulación de presión de las entradas. Por lo tanto, todos los orificios que no se utilizan deben cerrarse; por ejemplo, agujeros que se utilizan para cargar tejido en el chip. Si estos no están cerrados, el tejido puede fluir con el líquido. Para cerrar estos agujeros, se utilizan tubos llenos de PDMS. Los tubos llenos de PDMS se pueden mantener indefinidamente y, por lo tanto, no será necesario prepararlos para cada experimento de microfluídica por separado, sino que se pueden hacer en lotes más grandes. En segundo lugar, antes del inicio del experimento microfluídico, se preparan tubos, tubos llenos de PDMS y el chip, necesario para el experimento, y se esterilizan por UV. Finalmente, el chip tiene que ser recubierto con fibronectina, para que el tejido embrionario pueda adherirse al vidrio25. Fabricación de tubos rellenos de PDMS. Tome ±1 m de tubo. Se pueden llenar más tubos con PDMS tomando varias piezas de tubos. Prepare la cantidad requerida de PDMS mezclando el monómero con el catalizador en una proporción de 9:1 (w:w) para inducir la polimerización.NOTA: Use herramientas desechables para mezclar, como vasos de plástico y tenedores. Mezclar adecuadamente. Coloque la mezcla PDMS en un desecador y aplique al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar el aire de la mezcla PDMS.NOTA: Cubra el interior del desecador con tejidos en caso de que PDMS fluya. Llene una jeringa de 3 ml con PDMS. Llene con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire en la mezcla. Use fórceps para insertar la punta de una aguja de 22 G en el tubo.NOTA: Tenga cuidado de no perforar el tubo o los dedos con la aguja. Conecte el tubo a la jeringa llena de PDMS a través de la aguja. Utilice la bomba de jeringa para llenar el tubo, con un caudal de aproximadamente 500 μL/h. Tenga cuidado de no aplicar una presión demasiado alta para evitar la rotura de la bomba. Una vez que el tubo esté completamente lleno de PDMS, colóquelo en un plato de 15 cm y cure a temperatura ambiente (al menos durante la noche). Prepare el tubo y el chip para el experimento.NOTA: Se requiere el siguiente tubo para el experimento: primero, aproximadamente 50 cm de tubo por salida y segundo, aproximadamente 2-3 m por entrada (el tamaño exacto depende de la organización espacial de las bombas, incubadora o microscopio utilizados más adelante). El tubo de entrada debe ser largo para permitir que el medio de cultivo se equilibre con CO2 para el cultivo de embriones durante el experimento. Cortar el tubo en un ángulo de 45° para que se creen extremos puntiagudos; esto hará que sea más fácil insertar el tubo en los orificios del chip. Coloque una aguja en cada uno de los tubos de entrada. Consulte el paso 2.1.5. Corte los tubos llenos de PDMS en tapones de ±1 cm. Corte en un ángulo de 45 ° para que se creen extremos puntiagudos; esto hará que sea más fácil insertar el tubo en los orificios del chip. Se necesitan suficientes tapones para llenar cada orificio que no está unido a ningún tubo. Retire la cinta adhesiva del chip. Coloque todos los tubos con agujas unidas, el chip y los tapones en un plato y esterilice exponiendo a la luz UV durante ±15 min. Se puede utilizar cualquier campana de cultivo celular con posibilidad de esterilización UV. Recubrimiento de chip con fibronectina.NOTA: Para el cultivo de cultivos 2D ex vivo de PSM posterior, cubra el chip con fibronectina. Coloque el chip en un vaso de precipitados que contenga PBS + 1% de penicilina/estreptomicina a temperatura ambiente. Asegúrese de que el chip esté completamente cubierto con PBS. Enjuague el chip con PBS para eliminar el aire con una pipeta P200.NOTA: Todo el manejo posterior del chip se realizará en este vaso de precipitados hasta el inicio del experimento para evitar la entrada de aire en el chip. Tenga cuidado de no romper la diapositiva de vidrio del chip. Prepare 2 ml de fibronectina 1:20 en PBS y llénelo en un vaso de precipitados. Cargue una jeringa de 3 ml para cada cámara del chip. Con fórceps, inserte una aguja de 22 G en el tubo de salida. Conecte la aguja a la jeringa que contiene fibronectina. Conecte la jeringa a la bomba de la jeringa. Enjuague el tubo hasta que no quede aire en el tubo. Conecte el tubo de salida a la salida del chip. Asegúrese de empujar el tubo hasta el fondo. Establezca un caudal bajo para recubrir el chip. Todas las demás aberturas pueden permanecer abiertas. Deje que la bomba de la jeringa funcione durante al menos 2 h, también puede funcionar durante la noche. Detenga la bomba. Corte el tubo justo después de la aguja. El tubo restante servirá como salida durante el experimento más adelante. 3. Experimento de microfluídica NOTA: Aquí se presenta un protocolo para el arrastre del reloj de segmentación del ratón en cultivos 2D ex vivo mediante la aplicación de pulsos del inhibidor de señalización Notch DAPT. La aplicación de pulsos con un período de 130 min, cerca del período natural del reloj de segmentación del ratón (137 min25), permite un arrastre eficiente. Se aplican pulsos de 100 min de medio y 30 min de 2 μM DAPT (Figura 2A). La presencia de fármaco dentro del chip se controla mediante un tinte fluorescente. Los espectros de excitación y emisión de este tinte y el informador de señalización fluorescente deben ser lo suficientemente diferentes como para evitar el sangrado durante las imágenes en tiempo real de fluorescencia. Cuando se utilizan proteínas fluorescentes amarillas como reporteras de señalización, como el reportero de señalización Notch LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), se puede aplicar el tinte, Cascade Blue. Para identificar otras posibles combinaciones de tinte fluorescente y reportero, se puede utilizar el visor de espectros disponible gratuitamente. El efecto del arrastre puede detectarse mediante imágenes en tiempo real de reporteros de señalización dinámica5,10,32. Cada chip tiene dos cámaras de incubación. Esto permite la comparación directa de pulsos de fármacos (DAPT) para controlar pulsos (DMSO). Hacer medio y degasificar. El día del experimento, preparar 50 ml de medio de cultivo (DMEM-F12 suplementado con 0,5 mM de glucosa, 2 mM de glutamina y 1% de BSA, para obtener más información sobre el cultivo de tailbud de ratón ver25). Prepare jeringas llenas con el medio para el experimento. Preparar medio de cultivo en vasos de precipitados: Para arrastrar las oscilaciones de señalización Notch, prepare 6 mL de medio con 1.2 μL de DMSO + 10 μM Cascade Blue; 6 mL de medio de cultivo con 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; dos tubos con 6 mL de medio cada uno. Use al menos 6 ml de medio por jeringa. Cargue las jeringas con el medio. Asegúrese de etiquetar las jeringas que contienen medicamentos y DMSO. Desgasificar el chip dentro de PBS y las jeringas que contienen el medio en un desecador. Coloque las jeringas en un vaso de precipitados con la punta hacia arriba, para que el aire pueda escapar en la parte superior. Puede ocurrir que el chip flote y todavía esté lleno de burbujas. Estos serán eliminados posteriormente. Trate de eliminar / aspirar la mayoría de las burbujas de aire del chip usando una pipeta P200. Si queda algo de aire, este se eliminará durante el siguiente experimento. Instale jeringas en las bombas y conecte los tubos de entrada a las jeringas. Para captar la señalización de Notch, use dos bombas de jeringa, una que lleve las jeringas medianas, otra que lleve las jeringas de medicamento / DMSO. Deje que esto funcione a un caudal más alto (0,5 ml / h) hasta el inicio del experimento para eliminar las burbujas de aire del tubo. Tenga cuidado de ajustar los detalles de la jeringa (diámetro) correctamente en la bomba. Carga de tejido en el chip. Diseccionar tejido embrionario de ratón. Diseccionar la punta más posterior de la cola (tailbud). Coloque el tejido diseccionado en un medio de cultivo + 25 μM HEPES. Enjuague el chip con medio de cultivo + 25 μM HEPES usando un P200 para eliminar PBS. Cargue el tejido en el chip usando una pipeta P200 (Figura 1C). Asegúrese de no introducir burbujas de aire en el chip.NOTA: La carga eficiente requiere algo de práctica. Si el tejido no está orientado correctamente, podría ser posible girarlo succionándolo cuidadosamente y enjuagándolo nuevamente. Sin embargo, esto a menudo resulta en la muerte celular rápida. Después de cada paso de carga de tejido, cierre la entrada de carga de tejido correspondiente con un trozo de tubo lleno de PDMS. Asegúrese de que los tapones estén suficientemente empujados hacia abajo hasta la parte inferior del chip con pinzas romas. Después de que se hayan cargado todas las muestras, cierre las entradas/ salidas no utilizadas con trozos de tubos llenos de PDMS con fórceps contundentes. Montaje de configuración microfluídica. Reducir el caudal de las bombas microfluídicas. 60-100 μL/h funciona bien para los tailbuds embrionarios de ratón. A tasas de flujo más altas, se observó la muerte celular, presumiblemente debido a una cizalladura celular demasiado alta. El caudal acumulado de múltiples bombas no debe exceder estos 60-100 μL/h por cámara microfluídica en un momento dado. Conecte el tubo al chip microfluídico. Haga esto sin obtener burbujas de aire dentro del chip (esto se puede lograr asegurándose de que haya una gota de medio presente al final del tubo). Las salidas todavía están presentes desde el recubrimiento de fibronectina (véase 2.3). Una vez que todos los tubos estén unidos al chip, sáquelo del vaso de precipitados, séquelo adecuadamente, colóquelo en un plato y póngalo junto con aproximadamente 1,5 m de tubo de entrada en una incubadora (37 ° C, 20% O2, 5% CO2) para el cultivo nocturno. El tubo es permeable al gas; esto permitirá equilibrar el O2 y el CO2 en el medio. Alternativamente, para imágenes simultáneas de fluorescencia en tiempo real, el chip y el tubo de entrada de aproximadamente 1,5 m se colocan directamente en el microscopio. Un soporte para el chip, que se ajusta a los soportes estándar de placa de 96 pocillos, se proporciona en el Archivo Suplementario 3.NOTA: Asegúrese de que la humedad sea lo suficientemente alta durante la incubación. Si es necesario, agregue un tejido húmedo a la cámara de imágenes o incubadora para evitar la evaporación en la configuración de microfluídica. Si la humedad en la incubadora del microscopio es demasiado baja, esto resulta en la formación de burbujas de aire en el tubo y el chip microfluídico. A continuación, se puede utilizar una caja de imágenes cerrada, en la que se colocan chips y tubos. La forma más sencilla de hacer una caja de imágenes de este tipo es colocando una tapa grande sobre el chip y agregando un tejido húmedo, no tiene que cerrarse por completo. Asegúrese de que la diferencia de altura entre la bomba y el chip no sea demasiado grande y, si es necesario, cambie las alturas lentamente para evitar la formación de burbujas de aire debido a la gravedad. Deje que todas las bombas fluyan a un caudal de 20 μL/h durante 20 min, después de que la configuración se haya colocado en su ubicación final. Debido a que lo más probable es que la cámara y la bomba se hayan movido en altura, esto es necesario para restablecer la presión correcta en el tubo. Apague la bomba de la droga, deje que solo la bomba media funcione a 60 μL / h hasta el inicio del experimento / imágenes en tiempo real. Inicio del experimento. Inicie el programa de bombeo planificado para el experimento. Para arrastrar la señalización de Notch, use un programa de bombeo de pulsos de drogas de 100 minutos de medio y 30 minutos, que se repite hasta el final del experimento, generalmente durante 24 horas.NOTA: Se puede utilizar cualquier bomba microfluídica programable. En el formato más simple, las bombas se pueden programar e iniciar manualmente. Alternativamente, las bombas pueden ser controladas por un software de computadora. En caso de que se realicen imágenes en tiempo real, comience a tomar imágenes después de un período de al menos 30 minutos. Esto permitirá que la temperatura del chip se ajuste a la temperatura dentro de la incubadora y evitará una deriva demasiado fuerte durante la toma de imágenes. El enfoque automático sigue siendo beneficioso. Realice imágenes confocales estándar a través del portaobjetos de vidrio del chip utilizando un microscopio invertido. Utilice un intervalo de imagen de 10 minutos para detectar suficientemente las oscilaciones de señalización con un período de 130 minutos. Para períodos más cortos, acorte el intervalo para un muestreo suficiente. Incluya una pista de imágenes de baja resolución para la detección de Cascade Blue para visualizar la presencia de drogas en el chip. Para la excitación de un reportero de Venus, use un láser de 515 nm o un láser de 2 fotones a una longitud de onda de 960 nm. Adquiera una pila z de 6-8 planos con una distancia de 8 μm a través de un objetivo de plan 20x (resolución 512 x 512 píxeles, 1,38 μm / píxel). Utilice una etapa motorizada para obtener imágenes de varias muestras dentro de un experimento. Excite Cascade Blue con un láser de 405 nm y adquiera un solo plano z cada 10 min (resolución 32 x 32 píxeles, 22,14 μm/píxel).NOTA: Se proporciona más información sobre imágenes y análisis de imágenes en los Resultados representativos y se puede encontrar en la referencia10.