ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

ここで紹介する研究は、EMBL倫理委員会10 とオランダ動物研究委員会(dierenexperimentencommissie、DEC)によって承認されており、動物ケアに関するHubrechtガイドラインに従っています。 液体PDMSでの作業中は手袋を着用してください。表面と機器を覆います。こぼれたものは、固まると掃除が難しくなるので、すぐに取り除いてください。 1. チップの生成 注:マイクロ流体チップは、PDMS(ポリジメチルシロキサン)を金型に鋳造することによって生成されます。金型は、CADソフトウェア(uFlowや3DμF30など)を使用して設計できます。フリーデザインのリポジトリは、MIT (Metafluidics.org) によって提供されています。モールドは、3Dプリンタで印刷されるか、または所望のデザインを含むフォトマスクを用いたソフトリソグラフィーによって生成され得る(さらなる情報については、例えば、Qin et al., 201031を参照されたい)。ここでは、マウス胚組織のオンチップ培養用の3Dプリンタで印刷できる金型の設計を提供する(図1B,C,補足ファイル1,2)。低解像度の3Dプリンタで印刷できるように、以前に公開されたものと比較してデザインが変更されました10。気泡トラップのない金型と気泡トラップを備えた金型が用意されています(それぞれ補足ファイル1と2)。印刷手順は使用可能なプリンタに依存するため、印刷の詳細は説明しません。ただし、未重合の樹脂がすべて完全に除去されていることを確認する必要があります。マイクロ流体チャンバ内の小さな<200μmの穴から未重合樹脂を除去するために、溶剤で余分な洗浄を行う必要があることがよくあります。これらの穴はPDMSピラーを形成し、実験中にチップ内に胚組織をトラップします。PDMSは、安価で生体適合性があり、透明であり、自己蛍光が低いため、一般にマイクロ流体学に使用される。硬化後、PDMSチップを金型から切り出し、スライドガラス上に貼り合わせる。ガラスとPDMSチップの両方のプラズマ処理は、接触させると表面を活性化し、共有結合の形成を可能にします。 モノマーと触媒を9:1の比率(w:w)で混合して必要量のPDMSを調製し、重合を誘導する。使い捨ての道具を使って、プラスチック製のカップやフォークなどを混ぜる。混合が適切に達成されていることを確認してください。 PDMS混合物をデシケーターに入れ、約30分間真空を適用してPDMS混合物から空気を除去する。デシケーター内の真空により、PDMS混合物から空気が除去されます。メモ:PDMSが流れ落ちる場合に備えて、デシケータの内側を組織で覆ってください。 PDMS混合物をチップモールドに注ぎます(約3〜5mmのPDMS層で十分です)。 PDMSで満たされた金型をデシケーターに戻し、真空をかけて残りの気泡を除去します。金型のすべての小さな構造から空気が除去されていることを確認してください。 金型を65°C(金型材質によっては低い方)のオーブンに一晩入れて硬化させる。メスを使って型からチップを切り取ります。硬化したPDMSを、後で接着できるように、設計の周囲に十分なスペース(1〜2cm)で金型から切り取ります。取り出し時にチップが割れないように、PDMSを完全に切断してください。PDMSチップを慎重に持ち上げ、まずメスの鈍い端で、可能であれば手で持ち上げます。 パンチ入口および出口孔は、マイクロ流体チャンバの内側から出発して1mm生検パンチを使用した。 PDMSチップを圧縮空気で短時間清掃し、両面に粘着テープを貼ってPDMSやほこりの詰まった部分を取り除き、さらに使用するまで清潔に保ちます。注:チップは、さらに使用するまでこのように保持することができます。 スライドガラスを圧縮空気で拭きます。壊れないように注意してください。PDMSチップから粘着テープを取り外します。 プラズマオーブンを用いてチップをスライドガラスに接着する。以下の手順は、空気プラズマ用に最適化されています。注:ラボのプラズマオーブンのマニュアルを参照し、特定の実験の手順を最適化してください。 チップとスライドガラスをプラズマオーブンに入れ、接合する側面を上に向けて置きます。 プラズマオーブンに蓋をし、真空をかけながら所定の位置に保持し、真空が確立されるまで待ちます。 ガスボタンを押して ガス をオンにし、約1分間待ちます(圧力は約0.37mbarでなければなりません)。 ジェネレーターを押してプラズマを生成します(電源:9.0、時間:1分)。 終了したら、ポンプとガスをオフにします。換気してドアを開けます。 活性化された表面を互いに配置し、均等に圧力を加えることによって、チップをガラスに接着する。ガラスが割れないように注意してください。注:プラズマ処理が機能したことを確認するために、水テストを実行できます。ガラスの表面に水滴を置きます。プラズマ処理がうまくいけば、水滴を形成するのではなく、すぐに水が広がるはずです。 接合したチップを65°Cのオーブンに5分間置く。 チップの露出側を粘着テープで密封し、ほこりが入口に入らないようにします。メモ:チップは使用時まで保管することができます。それまではテープで開口部を閉じる必要があります。 2. マイクロ流体実験の準備 注:マイクロ流体実験を実行するには、次の準備手順が必要です:まず、マイクロ流体実験を実行すると、入口から出口への流体の流れが作成されます。チップ内の穴は、入口からの圧力蓄積のために出口として機能します。したがって、使用しないすべての穴は閉じる必要があります。たとえば、チップに組織をロードするために使用される穴などです。これらが閉じていない場合、組織は流体とともに流出する可能性があります。これらの穴を閉じるために、PDMS充填チューブが使用されます。PDMS充填チューブは無期限に保管できるため、マイクロ流体実験ごとに個別に準備する必要はありませんが、より大きなバッチで作成できます。第2に、マイクロ流体実験の開始前に、実験に必要なチューブ、PDMS充填チューブ、およびチップを調製し、UV滅菌する。最後に、チップをフィブロネクチンでコーティングして、胚組織をガラス25に付着させる必要があります。 PDMS充填チューブを作る。 ±1 mのチューブを取ります。複数のチューブを取ることによって、より多くのチューブをPDMSで充填することができる。 モノマーと触媒を9:1の比率(w:w)で混合して必要量のPDMSを調製し、重合を誘導する。メモ: プラスチック製のカップやフォークなど、使い捨ての工具を使用して混合します。適切に混ぜる。 PDMS混合物をデシケーターに入れ、約30分間真空を適用してPDMS混合物から空気を除去する。メモ:PDMSが流れ落ちる場合に備えて、デシケータの内側を組織で覆ってください。 3 mL シリンジに PDMS を充填します。混合物中の気泡の形成を防ぐために慎重に充填する。 鉗子を使用して、22G針の先端をチューブに挿入します。メモ:チューブや指を針で穿刺しないように注意してください。 チューブをPDMS充填シリンジに針を介して取り付けます。シリンジポンプを使用してチューブを充填し、流量は約500 μL/hです。ポンプの破損を防ぐために、高すぎる圧力をかけないように注意してください。 チューブがPDMSで完全に満たされたら、15cmの皿に入れ、室温で(少なくとも一晩)硬化させます。 実験用のチューブとチップを準備します。注:実験には、まず出口あたり約50cmのチューブ、2番目の入口あたり約2〜3mのチューブが必要です(正確なサイズは、後で使用するポンプ、インキュベーター、顕微鏡の空間構成によって異なります)。実験中に培養培地をCO2 で平衡化するために、入口チューブは長くする必要があります。 チューブを45°の角度で切断して、尖った端部を作成します。これにより、チューブをチップの穴に挿入することが容易になります。各入口チューブに針を 1 本取り付けます。ステップ 2.1.5 を参照してください。 PDMS充填チューブを±1cmのプラグに切断します。尖った端が作成されるように45°の角度でカットします。これにより、チューブをチップの穴に挿入することが容易になります。チューブに取り付けられていない各穴を埋めるのに十分なプラグが必要です。 チップから粘着テープを取り外します。 針が付いたチューブ、チップ、プラグをすべて皿に入れ、UV光に±15分間さらして滅菌します。UV滅菌の可能性のある任意の細胞培養フードを使用することができます。 フィブロネクチンによるチップのコーティング。注:後部PSMの2D エクスビボ 培養物の培養の場合、チップをフィブロネクチンでコーティングする。 室温でPBS + 1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むビーカーにチップを置きます。チップがPBSで完全に覆われていることを確認してください。チップをPBSでフラッシュし、P200ピペットで空気を除去します。注:チップへの空気の侵入を防ぐために、チップのさらなる取り扱いはすべて、実験の開始までこのビーカーで行われます。チップのスライドガラスを割らないように注意してください。 PBS中の1:20フィブロネクチン2mLを準備し、ビーカーに充填する。 チップの各チャンバーに3mLのシリンジをロードする。鉗子の場合は、22 G 針を出口チューブに挿入します。フィブロネクチンを含むシリンジに針を取り付ける。 シリンジをシリンジポンプに接続します。チューブに空気が残らなくなるまで、チューブを洗い流します。 コンセントチューブをチップのコンセントに取り付けます。チューブを底まで押してください。チップをコーティングするために低流量を設定します。他のすべての開口部は開いたままにしておくことができます。シリンジポンプを少なくとも2時間稼働させ、一晩実行することもできます。 ポンプを停止します。針の直後にチューブを切り落とします。残りのチューブは、後の実験中に出口として機能します。 3. マイクロフルイディクス実験 注:ここでは、Notchシグナル阻害剤DAPTのパルスを適用することによる2D エキソビボ 培養におけるマウスセグメンテーションクロックの同伴のためのプロトコルが提示される。マウスセグメンテーションクロック(137分25)の自然周期に近い130分の周期でパルスを印加すると、効率的な同伴が可能になります。培地の100分と2μM DAPTの30分のパルスが印加されます(図2A)。チップ内の薬物の存在は、蛍光色素を用いてモニターされる。この色素と蛍光シグナル伝達レポーターの励起スペクトルと発光スペクトルは、蛍光リアルタイムイメージング中のブリードスルーを防ぐのに十分なほど異なっていなければなりません。Notchシグナル伝達レポーターLuVeLu5(ルナティックフリンジ- ヴィーナス-ルナティックフリンジ)のような黄色蛍光タンパク質をシグナル伝達レポーターとして使用する場合、色素カスケードブルーを適用することができる。蛍光色素とレポーターの他の可能な組み合わせを同定するために、自由に利用可能なスペクトルビューアを使用することができる。同伴の効果は、動的シグナル伝達レポーター5、10、32のリアルタイムイメージングによって検出することができる。各チップには2つのインキュベーションチャンバがあります。これにより、薬物パルス(DAPT)と制御パルス(DMSO)を直接比較することができます。 培地と脱気を作る。 実験当日に、50 mLの培養液を調製した(0.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、および1% BSAを添加したDMEM-F12、マウス尾芽培養の詳細については25参照)。 実験用の培地を充填した注射器を用意する。ビーカーで培養培地を調製する:Notchシグナル伝達振動を同伴させるために、1.2μLのDMSO+ 10μMカスケードブルーを含む6mLの培地を調製する。2 μM DAPT + 10 μM カスケードブルーを含む 6 mL の培養液;それぞれ6mLの培地を含む2本のチューブ。シリンジあたり少なくとも6mLの培地を使用してください。シリンジに媒体をロードする。薬物とDMSOを含む注射器に必ずラベルを貼ってください。 PBS内のチップおよび媒体を含むシリンジをデシケーター内で脱気する。先端を上に向けてシリンジをビーカーに入れ、上部に空気が逃げることができるようにします。チップが浮いてもまだ泡で満たされていることがあります。これらは後で削除されます。 P200ピペットを使用してチップからほとんどの気泡を洗い流す/吸い上げてみてください。空気が残っている場合は、次の実験中に除去されます。 ポンプにシリンジを取り付け、シリンジに入口チューブを取り付けます。ノッチシグナリングを同伴させるには、2つのシリンジポンプを使用し、1つは媒体シリンジを運び、もう1つは薬物/ DMSOシリンジを運ぶ。実験開始まで、これをより高い流量(0.5 mL/h)で実行し、チューブから気泡を除去します。ポンプ内のシリンジの詳細(直径)を適切に設定するように注意してください。 チップへの組織の装填。 マウス胚組織を解剖する。尾の最も後部の先端(尾芽)を解剖する。解剖した組織を培養液+25μM HEPESに入れる。 P200 を使用して Hepes の培養液 + 25 μM HEPESでチップをフラッシュし、PBS を除去します。 P200ピペットを使用して組織をチップにロードします(図1C)。チップに気泡を混入させないようにしてください。メモ: 効率的な読み込みには、ある程度の練習が必要です。組織が適切に配向していない場合は、慎重に吸い出してもう一度洗い流すことで、組織を回すことができるかもしれません。しかし、これはしばしば迅速な細胞死をもたらす。 各組織ローディングステップの後、PDMS充填チューブ片を使用して、対応する組織ローディング入口を閉じます。プラグが鈍いピンセットを使用してチップの底部まで十分に押し下げられていることを確認します。 すべてのサンプルがロードされたら、鈍い鉗子を使用して、PDMSで満たされたチューブで未使用の入口/出口を閉じます。 マイクロ流体セットアップの組み立て。 マイクロ流体ポンプの流量を下げます。60-100 μL/hはマウス胚の尾芽によく作用します。より高い流速では、細胞死が観察された – おそらく細胞剪断が高すぎるためである。複数のポンプの累積流量は、所定の時間にマイクロ流体チャンバあたり60〜100μL/hを超えてはなりません。 チューブをマイクロ流体チップに取り付けます。チップ内に気泡が入らなくてもこれを行います(これは、チューブの端に媒体の滴が存在することを確認することによって達成できます)。フィブロネクチンコーティングからの出口は依然として存在する(2.3参照)。 すべてのチューブがチップに取り付けられたら、ビーカーから取り出して適切に乾燥させ、皿に入れ、これを約1.5mの入口チューブと一緒にインキュベーター(37°C、20%O2、5%CO2)に入れて一晩培養します。チューブはガス透過性です。これにより、培地中のO2とCO2の平衡化が可能になります。あるいは、同時蛍光リアルタイムイメージングのために、チップと約1.5mの入口チューブを顕微鏡に直接配置します。標準の96ウェルプレートホルダーに収まるチップ用のホルダーは、補足ファイル3に記載されています。注:インキュベーション中は湿度が十分に高いことを確認してください。必要に応じて、湿った組織をイメージングチャンバーまたはインキュベーターに追加して、マイクロフルイディクスセットアップでの蒸発を防ぎます。顕微鏡インキュベーター内の湿度が低すぎると、チューブおよびマイクロ流体チップ内に気泡が形成される。チップとチューブが置かれた閉じたイメージングボックスを使用することができます。このようなイメージングボックスを作る最も簡単な方法は、チップの上に大きな蓋を置き、ウェットティッシュを追加することで、完全に閉じる必要はありません。ポンプとチップの高低差が大きすぎないことを確認し、必要に応じて重力による気泡の発生を防ぐためにゆっくりと高さを変えてください。 セットアップが最終的な位置に置かれた後、すべてのポンプを20 μL/hの流量で20分間流します。チャンバとポンプの高さが移動している可能性が高いため、チューブ内の正しい圧力を再確立するために必要です。 薬剤ポンプの電源を切り、実験/リアルタイムイメージングの開始まで、培地ポンプのみを60 μL/hで稼働させます。 実験の開始。 実験用に計画されたポンピングプログラムを開始します。Notchシグナル伝達を同伴させるには、100分間の培地パルスと30分間の薬物パルスのポンピングプログラムを使用し、実験が終了するまで、通常は24時間繰り返す。メモ:任意のプログラム可能なマイクロ流体ポンプを使用できます。最も簡単なフォーマットでは、ポンプを手動でプログラムして起動することができます。あるいは、ポンプは、コンピュータソフトウェアによって制御することができる。 リアルタイムイメージングを行う場合は、30分以上経過してからイメージングを開始してください。これにより、チップの温度をインキュベーター内の温度に調整し、イメージング中のドリフトが強すぎるのを防ぐことができます。オートフォーカスはまだ有益です。 倒立顕微鏡を用いてチップのスライドガラスを介して標準的な共焦点イメージングを行う。10 分のイメージング間隔を使用して、130 分の周期でシグナリング振動を十分に検出します。 期間を短くする場合は、十分なサンプリングを行うために間隔を短くします。カスケードブルーを検出するための低解像度イメージングトラックを含めて、チップ上の薬物の存在を視覚化します。 金星レポーターの励起には、波長960nmの515nmレーザーまたは2光子レーザーを使用してください。 20倍の平面目標(解像度512 x 512ピクセル、1.38 μm/ピクセル)を介して、距離8 μmの6~8平面のzスタックを取得します。電動ステージを使用して、1回の実験で複数のサンプルをイメージングします。 カスケードブルーを405 nmレーザーで励起し、10分ごとに1つのzプレーンを集録します(解像度32 x 32ピクセル、22.14 μm/ピクセル)。注:イメージングおよび画像解析の詳細については、代表的な結果を参照し、参考文献10を参照してください。