Une approche microfluidique pour l’étude fonctionnelle des oscillations de signalisation régissant la somitogenèse

La recherche présentée ici a été approuvée par le comité d’éthique de l’EMBL10 et le comité néerlandais pour la recherche animale (dierenexperimentencommissie, DEC), et suit les directives de Hubrecht pour les soins aux animaux. Portez des gants lorsque vous travaillez avec du PDMS liquide. Couvrir les surfaces et l’équipement. Éliminez immédiatement tout déversement, car le nettoyage devient difficile une fois qu’il est durci. 1. Génération de la puce REMARQUE: Les puces microfluidiques sont générées par coulée de PDMS (polydiméthylsiloxane) dans un moule. Les moules peuvent être conçus à l’aide d’un logiciel de CAO (par exemple, uFlow ou 3DμF30). Un référentiel de conceptions gratuites est fourni par le MIT (Metafluidics.org). Les moules sont soit imprimés avec une imprimante 3D, soit peuvent être générés par lithographie douce à l’aide d’un photomasque contenant le design souhaité (pour plus d’informations, voir, par exemple, Qin et al., 201031). Ici, un dessin pour un moule est fourni qui peut être imprimé avec une imprimante 3D pour la culture sur puce de tissu embryonnaire de souris (Figure 1B, C, Fichiers supplémentaires 1 et 2). Pour permettre l’impression avec des imprimantes 3D de résolution inférieure, la conception a été modifiée par rapport à celle publiée précédemment10. Un moule sans pièges à bulles d’air et un autre avec des pièges à bulles d’air sont fournis (fichiers supplémentaires 1 et 2, respectivement). Comme la procédure d’impression dépend de l’imprimante disponible, les détails de l’impression ne seront pas décrits. Cependant, il faut s’assurer que toute la résine non polymérisée est entièrement éliminée. Il est souvent nécessaire d’effectuer un lavage supplémentaire avec des solvants pour éliminer la résine non polymérisée des petits trous de <200 μm dans la chambre microfluidique. Ces trous formeront des piliers PDMS pour piéger le tissu embryonnaire dans la puce pendant l’expérience. Le PDMS est généralement utilisé pour la microfluidique, car il est bon marché, biocompatible et transparent, et a une faible autofluorescence. Après durcissement, la puce PDMS est découpée dans le moule et collée sur une lame de verre. Le traitement au plasma du verre et de la puce PDMS active les surfaces et permet la formation de liaisons covalentes, lorsqu’elles sont mises en contact. Préparer la quantité requise de PDMS en mélangeant le monomère avec le catalyseur dans un rapport de 9:1 (w:w) pour induire la polymérisation. Utilisez des outils jetables pour mélanger, tels que des gobelets et des fourchettes en plastique. Assurez-vous que le mélange est correctement réalisé. Placez le mélange PDMS dans un dessiccateur et appliquez le vide pendant environ 30 minutes pour éliminer l’air du mélange PDMS. En raison du vide dans le dessiccateur, l’air sera retiré du mélange PDMS.REMARQUE: Couvrez l’intérieur du dessiccateur avec des tissus au cas où le PDMS coulerait. Versez le mélange PDMS dans le moule à copeaux (une couche PDMS d’environ 3 à 5 mm suffit). Replacez le moule rempli de PDMS dans le dessiccateur et appliquez le vide pour éliminer les bulles restantes. Assurez-vous que l’air est retiré de toutes les petites structures du moule. Durcissez le moule en le plaçant dans un four à 65 °C (ou moins selon le matériau du moule) pendant la nuit. Coupez la puce hors du moule à l’aide d’un scalpel. Coupez le PDMS durci hors du moule avec suffisamment d’espace (1-2 cm) autour de la conception pour permettre un collage ultérieur. Assurez-vous de couper complètement le PDMS pour éviter de casser la puce lorsque vous la retirez. Soulevez soigneusement la puce PDMS, d’abord avec l’extrémité émoussée du scalpel et, si possible, avec les mains. Percez les trous d’entrée et de sortie, en commençant par l’intérieur de la chambre microfluidique à l’aide d’un poinçon de biopsie de 1 mm. Nettoyez brièvement la puce PDMS avec de l’air comprimé et collez du ruban adhésif des deux côtés pour enlever les morceaux de PDMS et la poussière coincés et le garder propre jusqu’à une utilisation ultérieure.REMARQUE: La puce peut être conservée comme ceci jusqu’à une utilisation ultérieure. Nettoyez la glissière de verre avec de l’air comprimé. Faites attention à ce qu’il ne se casse pas. Retirez le ruban adhésif de la puce PDMS. Collez la puce à la lame de verre à l’aide d’un four à plasma. Les instructions suivantes sont optimisées pour le plasma d’air.REMARQUE: Consultez le manuel du four à plasma du laboratoire et optimisez la procédure pour l’expérience spécifique. Placez la puce et le verre glissés dans le four à plasma avec les côtés à coller vers le haut. Placez le couvercle sur le four à plasma et maintenez-le en place pendant l’application du vide et attendez que le vide se soit établi. Allumez le gaz en appuyant sur le bouton Gaz et attendez environ 1 min (la pression doit être d’environ 0,37 mbar). Générez du plasma en appuyant sur Générateur (Puissance: 9.0, Temps: 1 min). Lorsque vous avez terminé, éteignez la pompe et l’essence; aérez et ouvrez la porte. Collez la puce au verre en plaçant les surfaces activées les unes sur les autres et en appliquant une pression uniformément. Attention à ce que le verre ne se casse pas.REMARQUE: Un test d’eau peut être effectué pour confirmer que le traitement au plasma a fonctionné. Placez une goutte d’eau sur la surface du verre. Si le traitement au plasma a fonctionné, l’eau doit s’étaler immédiatement au lieu de former une gouttelette. Placer la puce collée dans un four à 65 °C pendant 5 min. Scellez le côté exposé de la puce avec du ruban adhésif pour empêcher la poussière de pénétrer dans les entrées.REMARQUE: La puce peut être conservée jusqu’à utilisation. Les ouvertures doivent être fermées avec du ruban adhésif jusque-là. 2. Préparation de l’expérience de microfluidique REMARQUE: Les étapes préparatoires suivantes sont nécessaires pour effectuer l’expérience de microfluidique: Tout d’abord, lors de l’exécution de l’expérience de microfluidique, un écoulement de fluide est créé des entrées vers les sorties. Tous les trous dans la puce fonctionneront comme des sorties en raison de l’accumulation de pression des entrées. Par conséquent, tous les trous qui ne sont pas utilisés doivent être fermés; par exemple, les trous qui sont utilisés pour charger le tissu sur la puce. Si ceux-ci ne sont pas fermés, le tissu peut s’écouler avec le liquide. Pour fermer ces trous, des tubes remplis de PDMS sont utilisés. Les tubes remplis de PDMS peuvent être conservés indéfiniment et, par conséquent, n’auront pas besoin d’être préparés séparément pour chaque expérience de microfluidique, mais peuvent être fabriqués en lots plus importants. Deuxièmement, avant le début de l’expérience microfluidique, les tubes, les tubes remplis de PDMS et la puce nécessaire à l’expérience sont préparés et stérilisés aux UV. Enfin, la puce doit être recouverte de fibronectine, afin que le tissu embryonnaire puisse se fixer au verre25. Fabrication de tubes remplis de PDMS. Prendre ±1 m de tube. Plus de tubes peuvent être remplis avec PDMS en prenant plusieurs morceaux de tubes. Préparer la quantité requise de PDMS en mélangeant le monomère avec le catalyseur dans un rapport de 9:1 (w:w) pour induire la polymérisation.REMARQUE: Utilisez des outils jetables pour mélanger, tels que des gobelets et des fourchettes en plastique. Mélanger correctement. Placez le mélange PDMS dans un dessiccateur et appliquez le vide pendant environ 30 minutes pour éliminer l’air du mélange PDMS.REMARQUE: Couvrez l’intérieur du dessiccateur avec des tissus au cas où le PDMS coulerait. Remplissez une seringue de 3 mL avec PDMS. Remplissez soigneusement pour éviter la formation de bulles d’air dans le mélange. Utilisez une pince pour insérer la pointe d’une aiguille de 22 G dans le tube.REMARQUE: Veillez à ne pas percer le tube ou vos doigts avec l’aiguille. Fixez le tube à la seringue remplie de PDMS via l’aiguille. Utilisez la pompe à seringue pour remplir le tube, avec un débit d’environ 500 μL/h. Veillez à ne pas appliquer une pression trop élevée pour éviter la rupture de la pompe. Une fois que le tube est entièrement rempli de PDMS, placez-le dans un plat de 15 cm et durcissez à température ambiante (au moins pendant la nuit). Préparez le tube et la puce pour l’expérience.REMARQUE: Les tubes suivants sont nécessaires pour l’expérience: premièrement, environ 50 cm de tubes par sortie et deuxièmement, environ 2-3 m par entrée (la taille exacte dépend de l’organisation spatiale des pompes, de l’incubateur ou du microscope utilisés ultérieurement). Le tube d’entrée doit être long pour permettre au milieu de culture de s’équilibrer avec le CO2 pour la culture d’embryons pendant l’expérience. Couper le tube à un angle de 45° de sorte que des extrémités pointues soient créées; cela facilitera l’insertion du tube dans les trous de la puce. Fixez une aiguille à chacun des tubes d’entrée. Voir l’étape 2.1.5. Coupez les tubes remplis de PDMS dans des bouchons de ±1 cm. Couper à un angle de 45° de sorte que des extrémités pointues soient créées; cela facilitera l’insertion du tube dans les trous de la puce. Suffisamment de bouchons sont nécessaires pour remplir chaque trou qui n’est attaché à aucun tuyau. Retirez le ruban adhésif de la puce. Placez tous les tubes avec des aiguilles attachées, la puce et les bouchons dans un plat et stérilisez en exposant à la lumière UV pendant ±15 min. Toute hotte de culture cellulaire avec la possibilité de stérilisation UV peut être utilisée. Revêtement de puce avec de la fibronectine.REMARQUE: Pour la culture de cultures 2D ex vivo de MSP postérieurs, enduisez la puce de fibronectine. Placer la puce dans un bécher contenant du PBS + 1% de pénicilline/streptomycine à température ambiante. Assurez-vous que la puce est complètement recouverte de PBS. Rincez la puce avec du PBS pour éliminer l’air avec une pipette P200.REMARQUE: Toute manipulation ultérieure de la puce sera effectuée dans ce bécher jusqu’au début de l’expérience pour empêcher l’entrée d’air dans la puce. Veillez à ne pas casser la lame de verre de la puce. Préparer 2 mL de fibronectine 1:20 dans le PBS et remplir dans un bécher. Chargez une seringue de 3 mL pour chaque chambre de la puce. Avec une pince, insérez une aiguille de 22 G dans le tube de sortie. Fixez l’aiguille à la seringue contenant de la fibronectine. Connectez la seringue à la pompe à seringue. Rincez le tube jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air dans le tube. Fixez le tuyau de sortie à la sortie de la puce. Assurez-vous de pousser le tube jusqu’au fond. Réglez un faible débit pour recouvrir la puce. Toutes les autres ouvertures peuvent rester ouvertes. Laissez la pompe à seringue fonctionner pendant au moins 2 h, peut également fonctionner pendant la nuit. Arrêtez la pompe. Coupez le tube juste après l’aiguille. Le tube restant servira de sortie pendant l’expérience plus tard. 3. Expérience de microfluidique REMARQUE: Ici, un protocole pour l’entraînement de l’horloge de segmentation de la souris dans des cultures 2D ex vivo en appliquant des impulsions de l’inhibiteur de signalisation Notch DAPT est présenté. L’application d’impulsions d’une durée de 130 min, proche de la période naturelle de l’horloge de segmentation de la souris (137 min25), permet un entraînement efficace. Des impulsions de 100 min de milieu et de 30 min de 2 μM de DAPT sont appliquées (Figure 2A). La présence de médicament dans la puce est surveillée à l’aide d’un colorant fluorescent. Les spectres d’excitation et d’émission de ce colorant et du rapporteur de signalisation fluorescente doivent être suffisamment différents pour éviter les saignements lors de l’imagerie en temps réel par fluorescence. Lorsque des protéines fluorescentes jaunes sont utilisées comme rapporteur de signalisation, telles que le rapporteur de signalisation Notch LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), le colorant, Cascade Blue, peut être appliqué. Pour identifier d’autres combinaisons possibles de colorant fluorescent et de rapporteur, une visionneuse de spectres disponible gratuitement peut être utilisée. L’effet de l’entraînement peut être détecté par l’imagerie en temps réel des rapporteurs de signalisation dynamique5,10,32. Chaque puce a deux chambres d’incubation. Cela permet la comparaison directe des légumineuses médicamenteuses (DAPT) pour contrôler les impulsions (DMSO). Faire moyen et dégazer. Le jour de l’expérience, préparer 50 mL de milieu de culture (DMEM-F12 complété par 0,5 mM de glucose, 2 mM de glutamine et 1% de BSA, pour plus d’informations sur la culture du bourgeon de queue de souris voir25). Préparez des seringues remplies du milieu pour l’expérience. Préparer le milieu de culture dans les béchers : Pour entraîner les oscillations de signalisation Notch, préparer 6 mL de milieu avec 1,2 μL de DMSO + 10 μM Cascade Blue ; 6 mL de milieu de culture avec 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; deux tubes de 6 mL de milieu chacun. Utilisez au moins 6 mL de milieu par seringue. Chargez les seringues avec le support. Assurez-vous d’étiqueter les seringues contenant du médicament et du DMSO. Dégazez la puce dans le PBS et les seringues contenant le milieu dans un dessiccateur. Placez les seringues dans un bécher avec la pointe tournée vers le haut, de sorte que l’air puisse s’échapper par le haut. Il peut arriver que la puce flotte et soit encore remplie de bulles. Ceux-ci seront supprimés par la suite. Essayez de rincer / aspirer la plupart des bulles d’air de la puce à l’aide d’une pipette P200. S’il reste de l’air, il sera éliminé lors de l’expérience suivante. Installez des seringues dans les pompes et fixez des tubes d’entrée aux seringues. Pour entraîner la signalisation Notch, utilisez deux pompes à seringues, l’une transportant les seringues moyennes, l’autre transportant les seringues de médicament / DMSO. Laissez-le fonctionner à un débit plus élevé (0,5 mL / h) jusqu’au début de l’expérience pour éliminer les bulles d’air du tube. Veillez à régler correctement les détails de la seringue (diamètre) dans la pompe. Chargement de tissu sur la puce. Disséquer le tissu embryonnaire de souris. Disséquez le bout le plus postérieur de la queue (queue). Placer le tissu disséqué dans un milieu de culture + 25 μM HEPES. Rincez la puce avec un milieu de culture + 25 μM HEPES à l’aide d’un P200 pour éliminer le PBS. Chargez le tissu dans la puce à l’aide d’une pipette P200 (Figure 1C). Assurez-vous de ne pas introduire de bulles d’air dans la puce.REMARQUE: Un chargement efficace nécessite un peu de pratique. Si le tissu n’est pas orienté correctement, il peut être possible de le retourner en aspirant soigneusement et en rinçant à nouveau. Cependant, cela entraîne souvent une mort cellulaire rapide. Après chaque étape de chargement des tissus, fermez l’entrée de chargement des tissus correspondante à l’aide d’un morceau de tube rempli de PDMS. Assurez-vous que les bouchons sont suffisamment poussés vers le bas de la puce à l’aide d’une pince à épiler émoussée. Une fois que tous les échantillons ont été chargés, fermez toutes les entrées/sorties inutilisées avec des morceaux de tubes remplis de PDMS à l’aide de pinces contondantes. Assemblage de la configuration microfluidique. Abaissez le débit des pompes microfluidiques. 60-100 μL / h fonctionne bien pour les bourgeons de queue d’embryon de souris. À des débits plus élevés, la mort cellulaire a été observée – probablement en raison d’un cisaillement cellulaire trop élevé. Le débit cumulé de plusieurs pompes ne doit pas dépasser ces 60-100 μL/h par chambre microfluidique à un moment donné. Fixez le tube à la puce microfluidique. Faites-le sans obtenir de bulles d’air à l’intérieur de la puce (cela peut être réalisé en s’assurant qu’il y a une goutte de milieu présente à l’extrémité du tube). Des sorties sont toujours présentes à partir du revêtement de fibronectine (voir 2.3). Une fois que tous les tubes sont attachés à la puce, sortez-les du bécher, séchez-les correctement, placez-les dans un plat et assemblez-les avec environ 1,5 m de tubes d’entrée dans un incubateur (37 °C, 20 % o2, 5 % de CO2) pour une culture de nuit. Le tube est perméable au gaz; cela permettra l’équilibrage de l’O2 et du CO2 dans le milieu. Alternativement, pour l’imagerie simultanée en temps réel par fluorescence, la puce et le tube d’entrée d’environ 1,5 m sont placés directement dans le microscope. Un support pour la puce, qui s’insère dans des supports de plaque standard à 96 puits, est fourni dans le dossier supplémentaire 3.REMARQUE: Assurez-vous que l’humidité est suffisamment élevée pendant l’incubation. Si nécessaire, ajoutez un tissu humide à la chambre d’imagerie ou à l’incubateur pour éviter l’évaporation dans la configuration microfluidique. Si l’humidité dans l’incubateur du microscope est trop faible, il en résulte la formation de bulles d’air dans le tube et la puce microfluidique. Une boîte d’imagerie fermée, dans laquelle sont placés la puce et le tube, peut ensuite être utilisée. Le moyen le plus simple de fabriquer une telle boîte d’imagerie est de placer un grand couvercle sur la puce et d’ajouter un tissu humide, il n’est pas nécessaire de la fermer complètement. Assurez-vous que la différence de hauteur entre la pompe et la puce n’est pas trop grande et, si nécessaire, changez de hauteur lentement pour éviter la formation de bulles d’air dues à la gravité. Laisser toutes les pompes s’écouler à un débit de 20 μL/h pendant 20 min, après que l’installation a été placée à son emplacement final. Étant donné que la chambre et la pompe ont très probablement bougé en hauteur, cela est nécessaire pour rétablir la pression correcte dans le tube. Éteignez la pompe à médicaments, laissez seulement la pompe moyenne fonctionner à 60 μL / h jusqu’au début de l’expérience / imagerie en temps réel. Début de l’expérience. Démarrez le programme de pompage prévu pour l’expérience. Pour entraîner la signalisation Notch, utilisez un programme de pompage de 100 min de milieu et 30 min d’impulsions de médicament, qui est répété jusqu’à la fin de l’expérience, généralement pendant 24 h.REMARQUE: Toute pompe microfluidique programmable peut être utilisée. Dans le format le plus simple, les pompes peuvent être programmées et démarrées manuellement. Alternativement, les pompes peuvent être contrôlées par un logiciel informatique. Dans le cas où une imagerie en temps réel est effectuée, commencez l’imagerie après une période d’au moins 30 minutes. Cela permettra à la température de la puce de s’ajuster à la température à l’intérieur de l’incubateur et d’éviter une dérive trop forte pendant l’imagerie. L’autofocus est toujours bénéfique. Effectuez une imagerie confocale standard via la lame de verre de la puce à l’aide d’un microscope inversé. Utilisez un intervalle d’imagerie de 10 min pour détecter suffisamment les oscillations de signalisation avec une période de 130 min. Pour des périodes plus courtes, raccourcissez l’intervalle pour un échantillonnage suffisant. Inclure une piste d’imagerie à basse résolution pour la détection de Cascade Blue afin de visualiser la présence de médicament sur la puce. Pour l’excitation d’un rapporteur de Vénus, utilisez un laser de 515 nm ou un laser à 2 photons à une longueur d’onde de 960 nm. Acquérir une pile z de 6-8 plans avec une distance de 8 μm à travers un objectif de plan 20x (résolution 512 x 512 pixels, 1,38 μm/pixel). Utilisez une scène motorisée pour imager plusieurs échantillons au sein d’une même expérience. Excitez Cascade Blue avec un laser de 405 nm et acquérez un seul plan z toutes les 10 minutes (résolution 32 x 32 pixels, 22,14 μm/pixel).REMARQUE : De plus amples renseignements sur l’imagerie et l’analyse d’images sont fournis dans les résultats représentatifs et se trouvent dans la référence10.