Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법
Summary
미세유동 칩 상에서 마우스 배아 조직의 배양 및 조작을 위한 프로토콜이 제공된다. 경로 조절제의 펄스를 적용함으로써, 이 시스템은 마우스 소미토제네시스의 기능적 조사를 위해 신호전달 진동을 외부적으로 제어하는데 사용될 수 있다.
Abstract
발달하는 마우스 배아의 전소성 중배엽의 주기적 분할은 신호전달 경로의 네트워크에 의해 조절된다. 신호 진동과 기울기는 각각 세그먼트 형성의 타이밍과 간격을 제어하는 것으로 생각됩니다. 관련된 신호 전달 경로가 지난 수십 년 동안 광범위하게 연구되었지만, somitogenesis를 제어하는 신호 진동의 기능에 대한 직접적인 증거는 부족했습니다. 신호 역학의 기능적 조사를 가능하게하기 위해, 미세 유체학은 이러한 역학의 미묘한 변조를위한 이전에 확립 된 도구입니다. 이 미세유체 기반 연행 접근법을 통해 내인성 신호 진동은 경로 조절기의 펄스에 의해 동기화됩니다. 이것은 예를 들어, 진동 기간 또는 두 진동 경로 사이의 위상 관계의 변조를 가능하게 한다. 또한, 경로 조절제의 공간 구배는 조직을 따라 확립되어 신호 구배의 특정 변화가 소미토제네시스에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 수 있다.
본 프로토콜은 미세유체학의 최초 사용자를 위한 미세유체 접근법을 확립하는 것을 돕기 위한 것이다. 미세 유체 시스템을 설정하는 데 필요한 기본 원리와 장비가 설명되고 칩 설계가 제공되어 3D 프린터를 사용하여 칩 생성을위한 금형을 편리하게 준비 할 수 있습니다. 마지막으로, 미세유체 칩 상에서 일차 마우스 조직을 배양하는 방법 및 경로 조절제의 외부 펄스에 대한 신호전달 진동을 수반하는 방법이 논의된다.
이러한 미세유체 시스템은 또한 다른 맥락에서 신호전달 역학 및 모르포겐 구배의 기능적 조사를 위해 위스트룰로이드 및 오가노이드와 같은 다른 생체 내 및 시험관내 모델 시스템을 보유하도록 적응될 수 있다.
Introduction
발달은 신호전달 경로를 통한 세포간 통신에 의해 제어된다. 조직과 공간의 적절한 세포 분화를 조율하는 신호 전달 경로의 수는 제한되어 있습니다. 이러한 다수의 프로세스를 조절하기 위해, 정보는 신호전달 경로의 역학, 신호1,2의 주파수 또는 지속기간과 같은 시간에 따른 경로의 변화로 인코딩될 수 있다.
소미토제네시스 동안, 소미틱 조직은 프레소미틱 중배엽(PSM)3으로부터 주기적으로 분절된다. PSM은 Wnt, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 레티노산 신호전달의 구배에 의해 공간적으로 조직된다. Wnt 및 FGF 신호가 낮은 결정 전방의 전방 PSM에서, 세포는 소미트로 분화하기 위해 프라이밍된다. 분화는 전사 활성화의 파동이 이러한 결정 전선에 도달할 때 발생한다. PSM 내에서, Wnt, FGF, 및 노치 신호전달이 발진한다. 이웃 세포는 위상에서 약간 벗어나 진동하며, 이로 인해 Wnt, FGF 및 Notch 경로의 하류에서 후방으로 이동하는 진동 전사 활성화의 파동이 발생합니다. 마우스 배아에서, 전사파는 대략 매 2 시간마다 결정 전면에 도달하고 소마이트 형성을 개시한다. 신호전달 경로를 교란시키거나 활성화시킴으로써 소미토제네시스를 연구하는 것은 이러한 경로의 중요성을 예시할 수 있다4,5,6,7,8,9. 그러나, 세포 거동의 조절에서 신호전달 역학의 기능을 조사할 수 있으려면, 신호전달 경로를 영구적으로 활성화하거나 억제하는 대신 미묘하게 조절하는 것이 필수적이다.
분절된 마우스 배아 내의 신호전달 경로 활성을 시간적으로 조절하기 위해, Sonnen et al.은 미세유체 시스템10을 개발하였다. 이 시스템은 생물학적 샘플11을 포함하는 칩의 마이크로채널 내에서 유체 유동의 엄격한 제어를 허용한다. PSM의 적절한 세분화를 위한 신호전달 역학의 중요성을 연구하기 위해, 이러한 미세유체학 셋업은 마우스 세그멘테이션 클럭 ex vivo의 신호전달 역학을 조절하는데 이용된다. 경로 활성화제 또는 억제제를 배양 챔버 내로 순차적으로 펄싱함으로써, Wnt, FGF 및 Notch 신호전달의 역학의 외부 조절이 달성된다10. 예를 들어, 개별 경로의 기간과 다수의 진동 신호전달 경로 사이의 위상 관계를 수정할 수 있다. 동적 신호 전달 리포터의 수반되는 실시간 이미징을 사용하여 경로 자체에 대한 연행의 효과, 분화 및 소마이트 형성에 미치는 영향을 분석 할 수 있습니다. 신호전달 역학에 대한 이러한 수준의 제어를 사용하여, 소미토제네시스 동안 Wnt-와 Notch-신호전달 경로 사이의 위상 관계의 중요성을 강조하였다10.
개인화된 칩 설계는 로컬 환경 내의 시공간 교란에 대한 많은 옵션, 예를 들어, 안정적인 기울기 형성12,13,14,15, 맥박 활성화/억제10,16,17,18 또는 국부적 교 란19,20 . Microfluidics는 또한 실험 처리의 자동화로 인해 더 재현 가능한 판독 및 더 높은 처리량을 가능하게 할 수 있습니다.21,22,23. 본 프로토콜은 미세유체학 및 조직 내의 내인성 신호전달 진동의 동반을 모든 표준 생명과학 실험실에 도입하기 위한 것이다. 클린 룸 및 소프트 리소그래피 장비와 같은 칩 생성을위한 정교한 장비가없는 경우에도 미세 유체 칩을 제조하고 생물학적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 금형은 자유롭게 사용할 수 있는 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있습니다. 일반적으로 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성된 미세유체 칩 생성용 금형은 3D 프린터로 인쇄하거나 인쇄 회사에서 주문할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 미세유체 칩은 고가의 장비의 요구 없이 하루 이내에 생산될 수 있다24. 여기서, 칩 설계가 제공되며, 이와 함께 2차원(2D) 생체외 배양물25에서 마우스 세그멘테이션 클럭의 연입을 위한 몰드가 3D 프린터로 인쇄될 수 있다.
미세 유체 공학에 의해 활성화 된 온칩 배양과 정확한 교란은 신호 전달 경로가 다세포 행동을 제어하는 방법의 분자 메커니즘을 푸는 데 탁월한 잠재력을 가지고 있습니다. 신호 역학 및 형태소 구배는 개발중인 많은 프로세스에 필요합니다. 이전에, 실험실은 세포, 조직 및 전체 유기체를 미세유체 칩에서 배양하였고, 주로 2D 세포 배양의 시공간 교란을 위한 프로토콜이 다른 곳에 제공되었다12,26,27,28,29. 다세포 시스템에서 로컬 환경을 변조하기 위해 미세유체학을 적용하면 높은 처리량과 정밀한 시공간 교란에 대한 새로운 관점이 열립니다. 미세 유체 공학 분야는 이제 발달 생물 학자들에게 비 전문적이고 저렴하며 쉽게 적용 할 수있는 도구가되었다는 점에 도달했습니다.
여기서, Notch 신호전달 억제제의 펄스에 대한 마우스 세그멘테이션 클럭의 연입에 대한 프로토콜이 제공된다. 이러한 실험은 (1) 미세유체 칩의 생성, (2) 튜브의 제조 및 칩의 코팅, 및 (3) 미세유체 실험 자체(도 1A)로 구성된다. 척추동물 모델 시스템과 관련된 연구는 책임있는 위원회의 사전 윤리적 승인이 필요합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신호 역학이 다세포 시스템을 어떻게 제어하는지는 이 분야에서 오랫동안 제기되어 왔습니다. 기능적 조사는 중요한 도전 과제인데, 왜냐하면 이러한 역학은 이것을 허용하기 위해 미묘하게 변조되어야하기 때문입니다.11. 경로 교란에 대한 이러한 시간적 제어는 원칙적으로 광유전학으로 달성될 수 있으며, 이는 또한 높은 공간 조절을 가능하게 한다34. 그러나 광유전학은 문제의 각 신호 전달 경로를 분석하기위한 정교한 유전 도구의 확립을 필요로합니다. 여기에 설명된 현재 프로토콜은 모든 신호전달 경로의 교란을 위한 매우 다재다능한 도구를 제공한다. 미세 유체 학적 실험을 통해 일시적으로 제어 된 약물 펄스를 적용하여 조직 배양에서 신호 전달 경로의 역학을 기능적으로 조사 할 수 있습니다. 여기서, 초점은 생체외 배양물에서의 소미토제네시스의 연구에 있지만, 프로토콜은 임의의 다른 모델 시스템에 적합하도록 적응될 수 있다.
프로토콜의 특정 단계는 성공적인 미세유체학 실험을 수행하는 데 매우 중요합니다(표 1에 요약됨). 요점은 다음과 같이 논의됩니다. 실험 과정 동안 배지 흐름으로 인해 조직 배양은 전단 스트레스를 경험합니다. 모델 시스템이 연속 흐름에 노출되면 세포 스트레스가 발생할 수 있으며 극단적 인 경우 전단 효과로 인한 세포 사멸이 발생할 수 있습니다. 마우스 테일 버드의 생체 외 조직 배양 및 현재 칩 설계의 경우, 60 μL / h (최대 100 μL / h)의 유량이 최소한의 전단 효과로 잘 작동하는 것으로 나타났습니다. 동일한 칩에 대해 여러 펌프가 동시에 켜지면 개별 펌프의 유량을 적절하게 조정하여 총 유량이 증가하지 않도록 해야 합니다. 현재 프로토콜이 다른 모델 시스템 및 칩 설계에 맞게 조정되면 유량이 최적화되어야 합니다. 대안적으로, 매질을 연속적으로 플러시하지 않고, chip35 상의 매질을 주기적으로 변경할 수 있다. 이러한 설정은 또한 마우스 소미토제네시스(미공개, 데이터 미도시)에서 신호전달 진동을 제어하는데 적용될 수 있다. 또한, 조직 배양이 직접적인 유체 흐름에 노출되지 않고 약물이 이웃 채널에서 확산되어 조직에 도달하는 설정도 구상 될 수 있습니다. 이러한 시스템은 ESC 분화의 시험관내 모델에 성장 인자의 구배를 적용하는데 성공적으로 사용되었다14,36.
미세 유체 실험의 한 가지 주요 쟁점은 실험 중에 기포가 온칩으로 발생한다는 것입니다. 칩 또는 튜브 내의 기포는 칩 상의 균일한 액체 흐름을 방해할 수 있고 그 위치에서 배아 배양물의 제거로 이어질 수 있다. 기포의 존재를 방지하기 위해, 프로토콜의 다양한 단계는 필수적이다. 먼저, 주사기 내의 배양 배지 및 미세유동 칩 자체는 데시케이터를 사용하여 탈기되어야 한다(단계 3.1.3). 둘째, 샘플을 로딩 입구에 로딩 할 때, 샘플과 함께 칩에 공기를 파이프하지 않도록주의해야합니다 (3.2.3 단계). 셋째, 튜브를 매체로 채울 때 칩을 부착하기 전에 모든 기포를 펌핑해야합니다 (3.3.2 단계). 그렇지 않으면, 이러한 기포는 실험 중에 메인 칩으로 밀려날 것이다. 마지막으로, 실험 동안, 배지는 반투과성 튜빙으로 인해 이미징 챔버 또는 인큐베이터 내에서 평형화된다. 튜빙의 투과성은 또한 매체의 증발을 허용하므로 튜브에 새로운 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 실험 중에 습도가 조절되도록하십시오.
일반적으로 미세 유체 공학은 연구자의 특정 질문에 적용 할 수있는 매우 다양한 도구입니다. 현재의 설계 접근 방식은 칩 당 최대 12 개의 생체 외 배양물을 병렬로 이미징 할 수 있습니다. 이 숫자는 주로 실험 당 배아의 수와 충분한 해상도로 각 배아 배양을 이미지화하는 데 걸리는 시간에 의해 제한됩니다. 단일 실험에서 여러 조건을 비교해야 하는 경우 단일 유리 슬라이드에 여러 칩을 장착할 수 있습니다. 칩 설계가 제공되어 여러 조직 외식편을 병렬로 이미징하는 데 이상적이지만 개인화 된 설계는 높은 처리량 분석을 허용하고 단일 실험 내에서 더 많은 조건의 조합을 증가시키기 위해 샘플 수의 한계를 극복 할 수 있습니다16,17. 마이크로유체학은 칩 상에서 배양될 수 있는 모델로 제한되며, 온칩 배양은 각 모델 시스템에 대해 개별적으로 최적화되어야 할 것이다27,37,38.
지난 5-10 년 동안 미세 유체 공학은 높은 처리량 접근법과 신호 역학 및 구배의 미묘한 변조에 대한 잠재력으로 인해 다양한 생물학적 질문을 해결하기 위해 적용되었습니다. 요즘 미세 유체 공학은 실험실에서 쉽게 설정할 수있는 쉽게 적용 할 수 있고 저렴하며 다재다능한 도구가되었습니다. 여기서, 현재의 프로토콜은 특정 응용, 즉 소미토제네시스를 지배하는 신호전달 역학을 연구하는 데 최적화되어 있다. 조직 생물학의 개별 연구 질문에 맞게 이 프로토콜과 디자인을 적용하는 것은 간단합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UMC 위트레흐트의 양 리와 조스 말다(Jos Malda)가 금형의 3D 프린팅에 도움을 준 것, 프로토콜에 대한 매우 유용한 피드백을 받은 Sonn넨 그룹의 Karen van den Anker, 현미경 내의 미세 유체 칩 홀더를 위한 Hubrecht Institute의 기계 워크샵의 Tjeerd Faase에게 감사드립니다. 우리는 원고를 비판적으로 읽은 Sonnen 그룹 전체와 건설적인 피드백에 대한 검토자에게 감사드립니다. 이 작품은 ERC 시작 보조금 계약 No. 850554 K.F.S.에 따라 유럽 연구위원회 (European Research Council)로부터 자금을 지원받았습니다.
Materials
| 10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
| 184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
| 184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
| 3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
| Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
| Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
| Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
| Compressed air system | |||
| Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Desiccator | VWR | 467-0104 | |
| Disposable cups | Duni | 173 941 | |
| Disposable forks | Staples | 511514 | |
| Dissection equipment | |||
| DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
| Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
| Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
| Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
| HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
| Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
| Oven | VWR | 390-09 | |
| PBS0 | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
| Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
| Scale | Sartorius | Entris | |
| Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
| Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
| Vacuum pump | VWR | 181-0308 |
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