Een protocol voor het kweken en manipuleren van embryonaal weefsel van muizen op een microfluïdische chip wordt verstrekt. Door pulsen van pathway modulators toe te passen, kan dit systeem worden gebruikt om signaaloscillaties extern te regelen voor het functionele onderzoek van muis somitogenese.
Periodieke segmentatie van het presomitische mesoderm van een zich ontwikkelend muizenembryo wordt gecontroleerd door een netwerk van signaalroutes. Van signaaloscillaties en gradiënten wordt gedacht dat ze respectievelijk de timing en afstand van segmentvorming regelen. Hoewel de betrokken signaalroutes de afgelopen decennia uitgebreid zijn bestudeerd, ontbreekt direct bewijs voor de functie van signaalschommelingen bij het beheersen van somitogenese. Om het functionele onderzoek van de signaaldynamica mogelijk te maken, is microfluïdica een eerder vastgesteld hulpmiddel voor de subtiele modulatie van deze dynamica. Met deze op microfluïdica gebaseerde entrainment-benadering worden endogene signaaloscillaties gesynchroniseerd door pulsen van pathway modulators. Dit maakt modulatie mogelijk van bijvoorbeeld de oscillatieperiode of de fase-relatie tussen twee oscillerende paden. Bovendien kunnen ruimtelijke gradiënten van pathwaymodulatoren langs het weefsel worden vastgesteld om te bestuderen hoe specifieke veranderingen in de signaalgradiënten somitogenese beïnvloeden.
Het huidige protocol is bedoeld om microfluïdische benaderingen te helpen vaststellen voor de eerste gebruikers van microfluïdica. De basisprincipes en apparatuur die nodig zijn om een microfluïdisch systeem op te zetten worden beschreven en er wordt een chipontwerp geleverd, waarmee een mal voor chipgeneratie gemakkelijk kan worden voorbereid met behulp van een 3D-printer. Ten slotte wordt besproken hoe primair muisweefsel op een microfluïdische chip kan worden gekweekt en hoe signaaloscillaties naar externe pulsen van pathwaymodulatoren kunnen worden meegevoerd.
Dit microfluïdische systeem kan ook worden aangepast om andere in vivo en in vitro modelsystemen zoals gastruloïden en organoïden te herbergen voor functioneel onderzoek van signaaldynamica en morfogeengradiënten in andere contexten.
De ontwikkeling wordt gecontroleerd door intercellulaire communicatie via signaalwegen. Er is slechts een beperkt aantal signaalwegen die de complexe vorming van weefsels en de juiste celdifferentiatie in ruimte en tijd orkestreren. Om deze veelheid aan processen te reguleren, kan informatie worden gecodeerd in de dynamiek van een signaalroute, de verandering van een pad in de loop van de tijd, zoals de frequentie of duur van een signaal1,2.
Tijdens somitogenese wordt somitisch weefsel periodiek afgesplitst van het presomitische mesoderm (PSM)3. De PSM is ruimtelijk georganiseerd door gradiënten van Wnt, Fibroblast Growth Factor (FGF) en Retinoïnezuursignalering. In anterieure PSM aan het bepalingsfront, waar Wnt- en FGF-signalen laag zijn, worden cellen klaargestoomd voor differentiatie in somites. Differentiatie treedt op wanneer een golf van transcriptionele activering dit bepalingsfront bereikt. Binnen de PSM, Wnt, FGF en Notch oscilleren signaleringen. Naburige cellen oscilleren enigszins uit fase, wat resulteert in golven van oscillerende transcriptionele activering stroomafwaarts van de Wnt-, FGF- en Notch-paden die van achterste naar voorste PSM reizen. Bij muizenembryo’s bereikt een transcriptionele golf ongeveer elke 2 uur het determinatiefront en initieert somietvorming. Het bestuderen van somitogenese door signaleringsroutes te verstoren of te activeren kan het belang van deze paden illustreren4,5,6,7,8,9. Om de functie van signaaldynamica in de controle van cellulair gedrag te kunnen onderzoeken, is het echter essentieel om signaalroutes subtiel te moduleren in plaats van ze permanent te activeren of te remmen.
Om de signaalwegactiviteit binnen het segmenterende muizenembryo tijdelijk te moduleren, hebben Sonnen et al. een microfluïdisch systeem ontwikkeld10. Dit systeem maakt een strakke controle mogelijk van vloeistofstromen binnen microkanalen van een chip die het biologische monster bevat11. Om het belang van signaaldynamiek voor een goede segmentatie van PSM te bestuderen, wordt deze microfluïdica-opstelling gebruikt om de signaaldynamiek van de muissegmentatieklok ex vivo te moduleren. Door sequentieel pulserende padactivatoren of -remmers in de kweekkamer te pulseren, wordt externe controle van de dynamiek van Wnt-, FGF- en Notch-signalering bereikt10. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de periode van individuele paden en de faserelatie tussen meerdere oscillerende signaalroutes te wijzigen. Met behulp van gelijktijdige real-time beeldvorming van dynamische signalerende verslaggevers kan het effect van entrainment op de paden zelf, op differentiatie en somietvorming worden geanalyseerd. Met behulp van dit niveau van controle over de signaaldynamiek werd het belang van de faserelatie tussen Wnt- en Notch-signaleringsroutes tijdens somitogenese benadrukt10.
Gepersonaliseerde chipontwerpen maken een overvloed aan opties mogelijk voor spatiotemporale verstoringen binnen de lokale omgeving, bijvoorbeeld stabiele gradiëntvorming12,13,14,15, pulsatiele activering / remming10,16,17,18 of gelokaliseerde verstoringen19,20 . Microfluïdica kan ook een meer reproduceerbare uitlezing en hogere doorvoer mogelijk maken dankzij automatisering van experimentele handling21,22,23. Het huidige protocol is bedoeld om microfluïdica en entrainment van endogene signaaloscillaties in weefsels naar elk standaard biowetenschappelijk laboratorium te brengen. Zelfs bij afwezigheid van geavanceerde apparatuur voor het genereren van chips, zoals cleanroom en apparatuur voor softlithografie, kunnen microfluïdische chips worden vervaardigd en gebruikt om biologische vragen aan te pakken. Mallen kunnen worden ontworpen met behulp van vrij beschikbare computerondersteunde ontwerpsoftware (CAD). Een mal voor het genereren van microfluïdische chips, meestal bestaande uit polydimethylsiloxaan (PDMS), kan worden geprint met een 3D-printer of worden besteld bij drukkerijen. Op deze manier kunnen microfluïdische chips binnen één dag worden geproduceerd zonder dat dure apparatuur nodig is24. Hier is een chipontwerp voorzien, waarmee met een 3D-printer een mal voor het meevoeren van de muissegmentatieklok in tweedimensionale (2D) ex vivo culturen25 kan worden geprint.
On-chip culturen en precieze verstoringen, mogelijk gemaakt door microfluïdica, hebben een uitstekend potentieel bij het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van hoe signaalroutes meercellig gedrag regelen. Signaaldynamica en morfogene gradiënten zijn nodig voor veel processen in ontwikkeling. Eerder hadden laboratoria cellen, weefsels en hele organismen gekweekt in microfluïdische chips en protocollen voor spatiotemporale verstoring van voornamelijk 2D-celkweek worden elders verstrekt12,26,27,28,29. Het toepassen van microfluïdica om lokale omgevingen in meercellige systemen te moduleren, opent nieuwe perspectieven voor high-throughput en nauwkeurige spatiotemporale verstoringen. Het gebied van microfluïdica heeft nu een punt bereikt dat het een niet-specialistisch, goedkoop en gemakkelijk toepasbaar hulpmiddel is geworden voor ontwikkelingsbiologen.
Hier wordt een protocol gegeven voor het meevoeren van de muissegmentatieklok naar pulsen van een Notch-signaleringsremmer. Zo’n experiment bestaat uit de volgende stappen: (1) generatie van microfluïdische chip, (2) voorbereiding van slangen en coating van de chip, en (3) het microfluïdische experiment zelf (figuur 1A). Onderzoek met modelsystemen voor gewervelde dieren vereist voorafgaande ethische goedkeuring van de bevoegde commissie.
Hoe signaaldynamiek meercellige systemen aanstuurt, is al lang een vraag in het veld. Functioneel onderzoek vormt een belangrijke uitdaging, omdat deze dynamiek subtiel moet worden gemoduleerd om dit mogelijk te maken11. Een dergelijke temporele controle over routeverstoringen kan in principe worden bereikt met optogenetica, die ook een hoge ruimtelijke controle mogelijk maakt34. Optogenetica vereist echter de oprichting van geavanceerde genetische hulpmiddelen voor de analyse van elke signaalroute in kwestie. Het huidige protocol dat hier wordt beschreven, biedt een zeer veelzijdig hulpmiddel voor de verstoring van elke signaalroute. Het microfluïdica-experiment maakt de toepassing van tijdelijk gecontroleerde medicijnpulsen mogelijk om de dynamiek van signaalroutes in weefselculturen functioneel te onderzoeken. Hier ligt de focus op de studie van somitogenese in ex vivo culturen, maar het protocol kan worden aangepast aan andere modelsystemen.
Bepaalde stappen in het protocol zijn van cruciaal belang om een succesvol microfluïdica-experiment uit te voeren (samengevat in tabel 1). De belangrijkste punten worden als volgt besproken. Door de medium flow in de loop van het experiment ervaart de weefselkweek schuifstress. Blootstelling van het modelsysteem aan continue stroming kan celstress en in extreme gevallen celdood veroorzaken als gevolg van het afschuivingseffect. Voor ex vivo weefselculturen van muisstaartdopjes en het huidige chipontwerp bleek een debiet van 60 μL/h (maximaal 100 μL/h) goed te werken met een minimaal afschuifeffect. Wanneer meerdere pompen tegelijkertijd worden ingeschakeld voor dezelfde chip, moet het debiet van afzonderlijke pompen dienovereenkomstig worden aangepast om geen toename van het totale debiet te veroorzaken. Wanneer het huidige protocol wordt aangepast aan andere modelsystemen en chipontwerpen, moet het debiet worden geoptimaliseerd. Als alternatief is het mogelijk om medium niet continu door te spoelen, maar periodiek medium op de chip te wisselen35. Een dergelijke opstelling kan ook worden toegepast om signaalschommelingen in muis somitogenese (ongepubliceerde, gegevens niet getoond) te regelen. Bovendien kan ook een opstelling worden voorgesteld, waarbij weefselculturen niet worden blootgesteld aan directe vloeistofstroom, maar geneesmiddelen het weefsel bereiken door diffusie vanuit een naburig kanaal. Dergelijke systemen zijn met succes gebruikt om gradiënten van groeifactoren toe te passen op in vitro modellen van ESC-differentiatie14,36.
Een belangrijk probleem van microfluïdische experimenten is het optreden van luchtbellen op de chip tijdens het experiment. Luchtbellen in de chip of slang kunnen interfereren met een uniforme vloeistofstroom op de chip en kunnen leiden tot verwijdering van de embryocultuur van zijn locatie. Om de aanwezigheid van luchtbellen te voorkomen, zijn verschillende stappen van het protocol onmisbaar. Eerst moet het kweekmedium in spuiten en de microfluïdische chip zelf worden ontgast met behulp van een exsiccator (stap 3.1.3). Ten tweede moet men bij het laden van monsters in de laadinlaten oppassen dat er geen lucht in de chip wordt gepipetteerd samen met het monster (stap 3.2.3). Ten derde moeten bij het vullen van de slang met medium alle luchtbellen worden weggepompt voordat de chip wordt bevestigd (stap 3.3.2). Anders worden deze bubbels tijdens het experiment in de hoofdchip geduwd. Ten slotte wordt het medium tijdens het experiment in evenwicht gebracht in de beeldvormingskamer of incubator vanwege de semi-permeabele slang. De permeabiliteit van de slang zorgt ook voor verdamping van het medium, dus zorg ervoor dat de vochtigheid tijdens het experiment wordt gereguleerd om de vorming van nieuwe bubbels in de slang te voorkomen.
Over het algemeen is microfluïdica een zeer veelzijdig hulpmiddel dat kan worden aangepast aan de specifieke vraag van de onderzoeker. De huidige ontwerpbenadering maakt het mogelijk om tot 12 ex vivo culturen parallel per chip in beeld te brengen. Dit aantal wordt voornamelijk beperkt door het aantal embryo’s per experiment en de tijd die nodig is om elke embryocultuur met voldoende resolutie in beeld te brengen. Als meerdere omstandigheden in één experiment moeten worden vergeleken, kunnen meerdere chips op één glasplaat worden gemonteerd. Er wordt een chipontwerp geleverd, dat ideaal is voor beeldvorming van meerdere weefselexplantaten parallel, maar gepersonaliseerde ontwerpen kunnen beperkingen in monsteraantal overwinnen om analyse met hoge doorvoer mogelijk te maken en de combinatie van meer omstandigheden binnen één experiment te vergroten16,17. Microfluïdica is beperkt tot modellen die op een chip kunnen worden gekweekt en de on-chipcultuur moet voor elk modelsysteem afzonderlijk worden geoptimaliseerd27,37,38.
In de afgelopen 5-10 jaar is microfluïdica toegepast om verschillende biologische vragen aan te pakken vanwege het potentieel voor benaderingen met hoge doorvoer en subtiele modulaties van signaaldynamiek en gradiënten. Tegenwoordig is microfluïdica een gemakkelijk toepasbaar, goedkoop en veelzijdig hulpmiddel geworden dat laboratoria gemakkelijk kunnen opzetten. Hier is het huidige protocol geoptimaliseerd voor een specifieke toepassing, namelijk het bestuderen van signaaldynamiek die somitogenese regelt. Het is eenvoudig om dit protocol en ontwerp aan te passen aan individuele onderzoeksvragen in de weefselbiologie.
The authors have nothing to disclose.
We zijn Yang Li en Jos Malda van het UMC Utrecht dankbaar voor hulp bij het 3D-printen van mallen, Karen van den Anker van de Sonnen groep voor zeer nuttige feedback op het protocol en Tjeerd Faase van de mechanische werkplaats van het Hubrecht Instituut voor de houder voor microfluïdische chips in de microscoop. We willen de hele Sonnen-groep bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript en de recensenten voor hun constructieve feedback. Dit werk ontving financiering van de European Research Council in het kader van een ERC-startsubsidieovereenkomst nr. 850554 K.F.S.
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |