Предусмотрен протокол культивирования и манипуляции эмбриональной тканью мыши на микрофлюидном чипе. Применяя импульсы модуляторов пути, эта система может быть использована для внешнего управления сигнальными колебаниями для функционального исследования мышиного сомитогенеза.
Периодическая сегментация пресомитической мезодермы развивающегося эмбриона мыши контролируется сетью сигнальных путей. Считается, что сигнальные колебания и градиенты контролируют время и интервал формирования сегментов соответственно. В то время как вовлеченные сигнальные пути были широко изучены в течение последних десятилетий, прямые доказательства функции сигнальных колебаний в контроле сомитогенеза отсутствовали. Чтобы обеспечить функциональное исследование динамики сигнализации, микрофлюидика является ранее установленным инструментом для тонкой модуляции этой динамики. При таком подходе, основанном на микрофлюидике, эндогенные сигнальные колебания синхронизируются импульсами модуляторов путей. Это позволяет модулировать, например, период колебаний или фазовую зависимость между двумя колебательными путями. Кроме того, пространственные градиенты модуляторов путей могут быть установлены вдоль ткани для изучения того, как специфические изменения в сигнальных градиентах влияют на сомитогенез.
Настоящий протокол призван помочь установить микрофлюидные подходы для начинающих пользователей микрофлюидики. Описаны основные принципы и оборудование, необходимые для настройки микрофлюидной системы, а также предусмотрена конструкция чипа, с помощью которой можно удобно подготовить форму для генерации чипа с помощью 3D-принтера. Наконец, обсуждается, как культивировать первичную ткань мыши на микрофлюидном чипе и как увлекать сигнальные колебания внешними импульсами модуляторов пути.
Эта микрофлюидная система также может быть адаптирована для размещения других модельных систем in vivo и in vitro , таких как гаструлоиды и органоиды, для функционального исследования динамики передачи сигналов и градиентов морфогенов в других контекстах.
Развитие контролируется межклеточной связью через сигнальные пути. Существует только ограниченное количество сигнальных путей, которые организуют сложное формирование тканей и правильную дифференцировку клеток в пространстве и времени. Чтобы регулировать это множество процессов, информация может быть закодирована в динамике сигнального пути, изменения пути с течением времени, такого как частота или продолжительность сигнала1,2.
Во время сомитогенеза сомитическая ткань периодически сегментируется от пресомитической мезодермы (ПСМ)3. PSM пространственно организован по градиентам Wnt, фактору роста фибробластов (FGF) и передаче сигналов ретиноевой кислоты. В передней части PSM на фронте определения, где сигналы Wnt и FGF низкие, клетки загрунтованы для дифференцировки в сомиты. Дифференциация возникает, когда волна транскрипционной активации достигает этого фронта детерминации. Внутри PSM, Wnt, FGF и Notch колеблются сигналы. Соседние клетки немного колеблются вне фазы, что приводит к волнам колебательной транскрипционной активации вниз по течению от путей Wnt, FGF и Notch, проходящих от заднего к переднему PSM. У эмбрионов мышей транскрипционная волна достигает фронта определения примерно каждые 2 ч и инициирует образование сомита. Изучение сомитогенеза путем возмущения или активации сигнальных путей может проиллюстрировать важность этих путей4,5,6,7,8,9. Однако, чтобы иметь возможность исследовать функцию динамики передачи сигналов в контроле клеточного поведения, важно тонко модулировать сигнальные пути, а не постоянно активировать или ингибировать их.
Чтобы временно модулировать активность сигнального пути в сегментирующем эмбрионе мыши, Sonnen et al. разработали микрофлюидную систему10. Эта система позволяет жестко контролировать потоки жидкости в микроканалах чипа, содержащего биологический образец11. Для изучения важности динамики сигнализации для правильной сегментации PSM эта микрофлюидная установка используется для модуляции динамики сигнализации часов сегментации мыши ex vivo. Путем последовательного пульсирования активаторов или ингибиторов пути в культуральную камеру достигается внешний контроль динамики передачи сигналов Wnt, FGF и Notch10. Например, можно модифицировать период отдельных путей и фазовую зависимость между несколькими колебательными сигнальными путями. Используя сопутствующую визуализацию динамических сигнальных репортеров в режиме реального времени, можно проанализировать влияние уноса на сами пути, на дифференцировку и образование сомита. Используя этот уровень контроля над динамикой сигнализации, была подчеркнута важность фазовой зависимости между Wnt- и Нотч-сигнальными путями во время сомитогенеза10.
Персонализированные конструкции чипов позволяют использовать множество вариантов пространственно-временных возмущений в локальной среде, например, формирование стабильного градиента12,13,14,15, пульсационную активацию/ингибирование10,16,17,18 или локализованные возмущения19,20 . Микрофлюидика также может обеспечить более воспроизводимое считывание и более высокую пропускную способность благодаря автоматизации экспериментальной обработки21,22,23. Настоящий протокол предназначен для передачи микрофлюидики и увлечения эндогенными сигнальными колебаниями внутри тканей в каждую стандартную лабораторию наук о жизни. Даже при отсутствии сложного оборудования для генерации чипов, такого как чистая комната и оборудование для мягкой литографии, микрофлюидные чипы могут быть изготовлены и использованы для решения биологических вопросов. Пресс-формы могут быть спроектированы с использованием свободно доступного программного обеспечения автоматизированного проектирования (CAD). Пресс-форма для генерации микрофлюидных чипов, обычно состоящая из полидиметилсилоксана (PDMS), может быть напечатана на 3D-принтере или заказана у полиграфических компаний. Таким образом, микрофлюидные чипы могут быть изготовлены в течение одного дня без необходимости дорогостоящего оборудования24. Здесь представлена конструкция чипа, с помощью которого с помощью 3D-принтера можно напечатать форму для утомления часов сегментации мыши в двумерных (2D) ex vivo культурах25.
Встроенные культуры и точные возмущения, обеспечиваемые микрофлюидикой, обладают выдающимся потенциалом в разгадке молекулярных механизмов того, как сигнальные пути контролируют многоклеточное поведение. Динамика передачи сигналов и градиенты морфогенов необходимы для многих процессов развития. Ранее лаборатории культивировали клетки, ткани и целые организмы в микрофлюидных чипах, а протоколы для пространственно-временного возмущения в основном 2D-культуры клеток представлены в другом месте12,26,27,28,29. Применение микрофлюидики для модуляции локальных сред в многоклеточных системах открывает новые перспективы для высокопроизводительных и точных пространственно-временных возмущений. Область микрофлюидики в настоящее время достигла точки, что она стала неспециализированным, недорогим и легко применимым инструментом для биологов развития.
Здесь приведен протокол для уноса часов сегментации мыши к импульсам сигнального ингибитора Notch. Такой эксперимент состоит из следующих этапов: (1) генерация микрофлюидного чипа, (2) подготовка трубки и покрытия чипа и (3) сам микрофлюидный эксперимент (рисунок 1А). Исследования, связанные с модельными системами позвоночных, требуют предварительного этического одобрения со стороны ответственного комитета.
Как динамика сигнализации управляет многоклеточными системами, было давним вопросом в этой области. Функциональное исследование представляет собой ключевую проблему, потому что эта динамика должна быть тонко модулирована, чтобы сделать это11. Такой временной контроль над возмущениями пути в принципе может быть достигнут с помощью оптогенетики, что также обеспечивает высокий пространственный контроль34. Однако оптогенетика требует создания сложных генетических инструментов для анализа каждого рассматриваемого сигнального пути. Текущий протокол, описанный здесь, предоставляет очень универсальный инструмент для возмущения любого сигнального пути. Эксперимент с микрофлюидикой позволяет применять импульсы с временным контролем препарата для функционального исследования динамики сигнальных путей в тканевых культурах. Здесь основное внимание уделяется изучению сомитогенеза в культурах ex vivo , но протокол может быть адаптирован к любым другим модельным системам.
Определенные шаги в протоколе имеют решающее значение для проведения успешного эксперимента по микрофлюидике (обобщено в таблице 1). Ключевые моменты обсуждаются следующим образом. Из-за течения среды в ходе эксперимента культура тканей испытывает напряжение сдвига. Воздействие непрерывного потока на модельную систему может вызвать клеточный стресс и в крайних случаях гибель клеток из-за эффекта сдвига. Было обнаружено, что для культур тканей ex vivo мышиных хвостов и текущей конструкции чипа скорость потока 60 мкл / ч (максимум 100 мкл / ч) хорошо работает с минимальным эффектом сдвига. Когда несколько насосов включаются одновременно для одной и той же стружки, расход отдельных насосов необходимо соответствующим образом регулировать, чтобы не вызвать увеличения общего расхода. Когда текущий протокол адаптирован к другим модельным системам и конструкциям чипов, скорость потока должна быть оптимизирована. В качестве альтернативы можно не промывать среду непрерывно, а периодически менять среду на чипе35. Такая установка также может быть применена для управления сигнальными колебаниями в сомитогенезе мыши (неопубликованные, данные не показаны). Кроме того, можно представить себе установку, в которой культуры тканей не подвергаются воздействию прямого потока жидкости, но лекарства достигают ткани путем диффузии из соседнего канала. Такие системы успешно используются для применения градиентов факторов роста к моделям дифференциации ЭКУ in vitro14,36.
Одной из основных проблем микрофлюидных экспериментов является появление пузырьков воздуха на чипе во время эксперимента. Пузырьки воздуха внутри чипа или трубки могут мешать равномерному потоку жидкости на чипе и могут привести к удалению культуры эмбриона из ее местоположения. Чтобы предотвратить наличие пузырьков воздуха, необходимы различные этапы протокола. Во-первых, культуральная среда внутри шприцев и сам микрофлюидный чип должны быть дегазированы с помощью адсорбциатора (этап 3.1.3). Во-вторых, при загрузке образцов в загрузочные отверстия необходимо соблюдать осторожность, чтобы не поставлять воздух в стружку вместе с образцом (этап 3.2.3). В-третьих, при заполнении трубки средой все пузырьки воздуха должны быть откачаны перед присоединением стружки (этап 3.3.2). В противном случае эти пузырьки будут выталкиваться в основной чип во время эксперимента. Наконец, во время эксперимента среда уравновешивается в камере визуализации или инкубаторе благодаря полупроницаемой трубке. Проницаемость трубки также позволяет испарять среду, поэтому убедитесь, что влажность регулируется во время эксперимента, чтобы предотвратить образование новых пузырьков в трубке.
В целом, микрофлюидика является очень универсальным инструментом, который может быть адаптирован к конкретному вопросу исследователя. Современный подход к проектированию позволяет создавать изображения до 12 культур ex vivo параллельно на чип. Это число в основном ограничено количеством эмбрионов в эксперименте и временем, необходимым для изображения каждой культуры эмбриона с достаточным разрешением. Если в одном эксперименте необходимо сравнить несколько условий, несколько чипов могут быть установлены на одном стеклянном слайде. Предусмотрена конструкция чипа, которая идеально подходит для параллельного изображения нескольких тканевых эксплантов, но персонализированные конструкции могут преодолеть ограничения в количестве образцов, чтобы обеспечить высокую пропускную способность анализа и увеличить комбинацию большего количества условий в рамках одного эксперимента16,17. Микрофлюидика ограничена моделями, которые могут быть культивированы на чипе, а культура на чипе должна быть оптимизирована для каждой модельной системы индивидуально27,37,38.
В течение последних 5-10 лет микрофлюидика применялась для решения различных биологических вопросов из-за ее потенциала для высокопроизводительных подходов и тонких модуляций динамики и градиентов сигнализации. В настоящее время микрофлюидика стала легко применимым, дешевым и универсальным инструментом, который лаборатории могут легко создать. Здесь текущий протокол оптимизирован для конкретного применения, а именно, изучения динамики сигнализации, управляющей сомитогенезом. Легко адаптировать этот протокол и дизайн в соответствии с индивидуальными исследовательскими вопросами в биологии тканей.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Ян Ли и Джосу Мальде из UMC Utrecht за помощь в 3D-печати пресс-форм, Карен ван ден Анкер из группы Sonnen за очень полезную обратную связь по протоколу и Тьерду Фаазе из механической мастерской в Институте Хубрехта за держатель для микрофлюидных чипов в микроскопе. Мы хотели бы поблагодарить всю группу Sonnen за критическое прочтение рукописи и рецензентов за их конструктивную обратную связь. Эта работа получила финансирование от Европейского исследовательского совета в рамках стартового грантового соглашения ERC No 850554 k.F.S.
10 mL syringe | Becton, Dickinson and company | 300912 | |
184 Silicon Elastomer curing agent | SYLGARD | 1673921 | |
184 Silicon Elastomer PDMS | SYLGARD | 1673921 | |
3 ml syringes | Becton, Dickinson and company | 309657 | |
Adhesive tape | Scotch Magic tape or similar | ||
Blunt-tip forceps Bochem 18/10 Stainless steel | Fisher Scientific | 10663341 | |
Bovine Serum albumin Lyophilised pH~7 | Biowest | P6154 | |
Compressed air system | |||
Crystallizing dish | VWR | 10754-7 | Sterilized |
D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
Desiccator | VWR | 467-0104 | |
Disposable cups | Duni | 173 941 | |
Disposable forks | Staples | 511514 | |
Dissection equipment | |||
DMEM/F12 | Cell culture technologies | custom | DMEM/F-12, no phenol red, no L-glutamine, no Glucose |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Flow hood BioVanguard Greenline | CleanAir by Baker | 511514 | For UV light source |
Glass slide No 1.5H high precision, 70×70 mm | Marienfeld | 107999098 | |
HEPES Buffer | Gibco | 15630-056 | |
L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
Microscope | Leica | Leica SP8 MP | |
Needles 22G | Becton, dickinson and company | z412139-100EA | |
Oven | VWR | 390-09 | |
PBS0 | |||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
Plasma oven Femto | Diener electronic | ||
Punch Ø 1mm | Uni-Core | WB100073 | |
Scale | Sartorius | Entris | |
Syringe pump | WPI | AL-4000 | |
Tubing Ø 1mm | APT | AWG24T | |
Vacuum pump | VWR | 181-0308 |