Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi
Summary
Burada sıçan substantia nigra pars compacta dopaminerjik nöron sayısının yarı nicel belirlenmesi için otomatik bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Substantia nigradaki dopaminerjik nöronların sayısının tahmin edilmesi klinik öncesi Parkinson hastalığı araştırmalarında önemli bir yöntemdir. Şu anda, tarafsız stereolojik sayım bu hücrelerin ölçülmesi için standarttır, ancak tüm projeler için mümkün olmayabilecek zahmetli ve zaman alıcı bir süreç olmaya devam etmektedir. Burada, önceden tanımlanmış bir ilgi alanında etiketli hücrelerin miktarını doğru bir şekilde tahmin edebilen bir görüntü analizi platformunun kullanımını açıklıyoruz. Sıçan beyninde bu analiz yöntemi için adım adım bir protokol açıklıyoruz ve substantia nigradaki mutant α-sinüklein ekspresyumu nedeniyle tirozin hidroksilaz pozitif nöronlarında önemli bir azalma tanımlayabileceğini gösteriyoruz. Bu metodolojiyi tarafsız stereoloji ile elde edilen sonuçlarla karşılaştırarak doğruladık. Birlikte ele alındığında, bu yöntem dopaminerjik nöron sayısındaki değişiklikleri tespit etmek için zaman verimli ve doğru bir süreç sağlar ve bu nedenle müdahalelerin hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin verimli bir şekilde belirlenmesi için uygundur.
Introduction
Parkinson hastalığı (PD), α-sinüklein (α-syn) içeren protein agregalarının varlığı ve substantia nigra pars compacta (SNpc)1’dedopaminerjik nöronların tercihli kaybı ile karakterize yaygın bir nörodejeneratif hareket bozukluğudur. Dopaminerjik nöron sayısının ölçülmesi, nigrostriatal sistemin bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verdiği için PD araştırmasının hayati bir parçasıdır, bu nedenle potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için önemli bir uç nokta sağlar. Şu anda, hücre sayısının ölçülmesi için standart, üç boyutlu (3D) yapılarda hacimsel özellikleri tahmin etmek için dokunun iki boyutlu (2D) kesitlerini kullanan tarafsız stereolojiksayımdır 2,3,4. Modern tasarım tabanlı stereolojik yöntemler, kapsamlı rastgele örnekleme prosedürleri uygular ve potansiyel yapıtları ve sistematik hataları önlemek için sayım protokolleri (problar olarak bilinir) uygular ve farklılıkların hayvanlar arası varyasyondan sadece biraz daha büyük güvenilir bir şekilde tespit edilmesine izin verir5. Stereology in vivo histolojik çalışmalar için güçlü bir analitik araç sağlarken, zaman yoğundur, tek tip numune hazırlamayı varsayar ve klinik öncesi çevirisel araştırma için giderek daha fazla gerekli olan verimliliği etkileyebilecek birkaç adımda doğrulama gerektirir.
Dijital bilimdeki son teknolojik gelişmeler, bir yandan stereomikroskop olmadan patolojinin daha verimli değerlendirilmesi için yeni uygulamaların benimsenmesini mümkün getirirken, bir yandan da tarafsız stereolojinin bir vekili olarak bir ihtiyacı dolduruyor. Bu yöntemler hızı arttırır, insan hatasını azaltır vesterolojik tekniklerin tekrarlanabilirliğini artırır6,7. HALO, dijital patolojide nicel doku analizi için böyle bir görüntü analizi platformudur. Çeşitli modüllerden oluşur ve örüntü tanıma algoritmalarını kullanarak tüm doku bölümlerinde hücre bazında morfolojik ve çoklanmış ifade verilerini raporlar. Cytonükleer FL modülü, çekirdek veya sitoplazmadaki floresan belirteçlerin immünofluoresan pozitifliğini ölçer. Bu, her işaretleyici için pozitif hücre sayısının ve her hücrenin yoğunluk puanının bildirilmesini sağlar. Modül, dopaminerjik nöronların ölçülmesi için gerekli olmasa da, bireysel hücre boyutları ve yoğunluk ölçümleri sağlamak için uyarlanabilir.
Bu çalışmanın amacı, nigral nörodejenerasyon 8 ,9,10’undahaönce doğrulanmış viral vektör bazlı α-syn sıçan modeli ile bu yöntemi doğrulamaktır. Bu modelde, insan mutant A53T α-syn, SNpc’de adeno ilişkili virüs hibrid serotip 1/2’nin (AAV1/2) stereotaktik enjeksiyonu ile ifade edilir ve 6 haftalık bir süre boyunca önemli nörodejenerasyon ile sonuçlanır. Kontrallateral uninjected SNpc, bazı çalışmalarda, enjekte edilen taraf için bir iç kontrol görevi görebilir. Daha yaygın olarak, hayvanların bir kontrol kohortuna AAV-Boş Vektör (AAV-EV) enjeksiyonu negatif kontrol olarak kullanılır. Otomatik bir görüntü analiz yazılımı kullanarak 6 hafta sonra enjekte edilen SNpc’de kalan dopaminerjik nöronların yoğunluğunu tahmin etmek için adım adım bir kılavuz sunuyoruz (Şekil 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
PD’nin klinik öncesi modellerinde dopaminerjik sistemin bütünlüğünün güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi, potansiyel hastalık değiştirici terapötiklerin etkinliğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, histopatolojik verilerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini azaltabilecek potansiyel kafa karıştırıcıları kontrol etmek ve en aza indirmek önemlidir. Dikkatli nicel sonuçlar, tek başına nitel veya yarı nicel açıklamalardan daha fazla bilgi sağlayabilir. Aynı zamand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Üniversite Sağlık Ağı’ndaki İleri Optik Mikroskopi Tesisi’ndeki (AOMF) tüm personele bu protokolün geliştirilmesinde zamanları ve yardımları için teşekkür eder.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
