تحديد شبه كمي لكثافة الخلايا العصبية الدوبامين في Substantia Nigra من نماذج القوارض باستخدام تحليل الصورة الآلي
Summary
هنا نقدم طريقة آلية لتحديد شبه كمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين في الجرذ substantia nigra pars compacta.
Abstract
تقدير عدد الخلايا العصبية الدوبامين في نيجرا substantia هو وسيلة رئيسية في أبحاث مرض باركنسون قبل السريرية. وفي الوقت الراهن، فإن العد غير المتحيز للخلايا هو المعيار للقياس الكمي لهذه الخلايا، ولكنه لا يزال عملية شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وقد لا تكون مجدية لجميع المشاريع. هنا، نقوم بوصف استخدام منصة تحليل الصور، والتي يمكنها تقدير كمية الخلايا المسماة بدقة في منطقة اهتمام محددة مسبقا. نحن نصف بروتوكول خطوة بخطوة لهذه الطريقة في التحليل في دماغ الفئران ونثبت أنه يمكن تحديد انخفاض كبير في الخلايا العصبية الإيجابية هيدروكسيلوز التيروزين بسبب التعبير عن متحولة α سينوكلين في نيجرا substantia. لقد صدقنا على هذه المنهجية من خلال المقارنة مع النتائج التي تم الحصول عليها من خلال التجسم غير المتحيز. معا, هذه الطريقة توفر عملية فعالة من حيث الوقت ودقيقة للكشف عن التغيرات في عدد الخلايا العصبية الدوبامين, وبالتالي مناسبة لتحديد كفاءة تأثير التدخلات على بقاء الخلية.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو اضطراب الحركة العصبية السائدة التي تتميز بوجود مجاميع البروتين التي تحتوي على α-سينوكلين (α-syn) والخسارة التفضيلية للخلايا العصبية الدوبامين في substantia nigra pars compacta (SNpc)1. يعد التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين جزءا حيويا من أبحاث PD لأنه يسمح بتقييم سلامة النظام النيغروستريتال ، وبالتالي ، مما يوفر نقطة نهاية مهمة لتقييم فعالية العلاجات المحتملة لتعديل المرض. حاليا، معيار القياس الكمي لعدد الخلية هو عد غير متحيزة stereological، والذي يستخدم ثنائي الأبعاد (2D) المقاطع العرضية من الأنسجة لتقدير السمات الحجمية في الهياكل ثلاثية الأبعاد (3D)2،3،4. تستخدم الأساليب الحديثة القائمة على التصميم إجراءات أخذ عينات عشوائية شاملة وتطبق بروتوكولات العد (المعروفة باسم المسابير) لتجنب القطع الأثرية المحتملة والأخطاء المنهجية ، مما يسمح بالكشف الموثوق عن الاختلافات أكبر قليلا فقط من الاختلاف بينالحيوانات 5. في حين أن علم الجسم يوفر أداة تحليلية قوية للدراسات النسيجية الحية ، إلا أنه يستغرق وقتا طويلا ، ويفترض إعداد عينات موحدة ، ويتطلب التحقق من الصحة في عدة خطوات ، والتي يمكن أن تؤثر على الكفاءة المطلوبة بشكل متزايد للتحقيق قبل السريرية.
إن التقدم التكنولوجي الحديث في العلوم الرقمية يجعل من الممكن اعتماد تطبيقات جديدة لتقييمات أكثر كفاءة لعلم الأمراض دون منظار مجسم ، مع تلبية الحاجة كبديل للتجسيم غير المتحيز. هذه الأساليب تزيد من السرعة ، والحد من الخطأ البشري ، وتحسين استنساخ التقنيات stereological6،7. هالو هي واحدة من هذه منصة تحليل الصور لتحليل الأنسجة الكمية في علم الأمراض الرقمية. وهو يتألف من مجموعة متنوعة من وحدات مختلفة وتقارير بيانات التعبير المورفولوجية ومتعددة الخلايا على أساس كل خلية على حدة عبر أقسام الأنسجة بأكملها باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط. تقيس وحدة FL النووية النووية الإيجابية المناعية لعلامات الفلورسنت في النواة أو السيتوبلازم. وهذا يسمح للإبلاغ عن عدد الخلايا الموجبة لكل علامة، ودرجة كثافة لكل خلية. يمكن تكييف الوحدة لتوفير أحجام الخلايا الفردية وقياسات الكثافة ، على الرغم من أن هذه الميزة ليست مطلوبة للقياس الكمي للخلايا العصبية الدوبامين.
والهدف من هذه الدراسة هو التحقق من هذه الطريقة مع نموذج الفئران الفيروسية التي تم التحقق من صحتها سابقا على أساس ناقلات α سين من التنكس العصبي nigral8,9,10. في هذا النموذج, الإنسان متحولة A53T α-syn وأعرب في SNpc عن طريق الحقن المجسمة من الفيروس المرتبطة أدينو الهجين النمط المصلي 1/2 (AAV1/2), مما أدى إلى تنكس عصبي كبير على مدى فترة 6 أسابيع. قد تكون SNpc غير المنضروبة ، في بعض الدراسات ، بمثابة مراقبة داخلية للجانب المحقون. أكثر شيوعا، يتم استخدام حقن ناقلات AAV فارغة (AAV-EV) في مجموعة مراقبة من الحيوانات كتحكم سلبي. نقدم دليل خطوة بخطوة لتقدير كثافة الخلايا العصبية الدوبامين المتبقية في SNpc حقن بعد 6 أسابيع باستخدام برنامج تحليل الصور الآلي (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
التقييم الموثوق لسلامة النظام الدوبامين في نماذج ما قبل السريرية من PD أمر بالغ الأهمية لتحديد فعالية العلاجات المحتملة تعديل المرض. لذلك، من المهم السيطرة على الإرباكات المحتملة التي قد تقلل من موثوقية البيانات الهستوبولوجية وإعادة إنتاجها وتقليلها. ويمكن أن توفر النتائج الكمية الدقيق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع العاملين في مرفق الفحص المجهري البصري المتقدم في الشبكة الصحية الجامعية على وقتهم ومساعدتهم في وضع هذا البروتوكول.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
