Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine weit verbreitete neurodegenerative Bewegungsstörung, die durch das Vorhandensein von Proteinaggregaten gekennzeichnet ist, die α-Synuclein (α-syn) enthalten, und den bevorzugten Verlust dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra pars compacta (SNpc)¹. Die Quantifizierung der dopaminergen Neuronenzahl ist ein wesentlicher Bestandteil der PD-Forschung, da sie die Bewertung der Integrität des nigrostriatalen Systems ermöglicht und somit einen wichtigen Endpunkt zur Beurteilung der Wirksamkeit potenzieller krankheitsmodifizierender Therapeutika darstellt. Derzeit ist der Standard für die Quantifizierung der Zellzahl die unvoreingenommene stereologische Zählung, die zweidimensionale (2D) Querschnitte von Gewebe verwendet, um volumetrische Merkmale in dreidimensionalen (3D) Strukturen^{abzuschätzen 2,3,4}. Moderne designbasierte stereologische Methoden verwenden umfassende Stichprobenverfahren und wenden Zählprotokolle (sogenannte Sonden) an, um potenzielle Artefakte und systematische Fehler zu vermeiden, so dass Unterschiede, die nur geringfügig größer sind als die Variation zwischen den Tieren, zuverlässig erkannt werden^{können 5.} Während die Sterologie ein leistungsfähiges Analysewerkzeug für histologische In-vivo-Studien darstellt, ist sie zeitintensiv, setzt eine einheitliche Probenvorbereitung voraus und erfordert eine Validierung in mehreren Schritten, was sich auf die Effizienz auswirken kann, die zunehmend für präklinische translationale Untersuchungen erforderlich ist.

Jüngste technologische Fortschritte in der digitalen Wissenschaft ermöglichen es, neuartige Anwendungen für effizientere Beurteilungen der Pathologie ohne Stereomikroskop zu übernehmen und gleichzeitig den Bedarf als Ersatz für unvoreingenommene Stereologie zu decken. Diese Methoden erhöhen die Geschwindigkeit, reduzieren menschliche Fehler und verbessern die Reproduzierbarkeit stereologischer Techniken^6,7. HALO ist eine solche Bildanalyseplattform für die quantitative Gewebeanalyse in der digitalen Pathologie. Es besteht aus einer Vielzahl verschiedener Module und berichtet morphologische und multiplexte Expressionsdaten auf Zell-für-Zell-Basis über ganze Gewebeschnitte mit Hilfe von Mustererkennungsalgorithmen. Das zytonukleäre FL-Modul misst die immunfluoreszierende Positivität von fluoreszierenden Markern im Zellkern oder Zytoplasma. Dies ermöglicht die Meldung der Anzahl der positiven Zellen für jeden Marker und des Intensitätswerts für jede Zelle. Das Modul kann angepasst werden, um individuelle Zellgrößen und Intensitätsmessungen bereitzustellen, obwohl diese Funktion für die Quantifizierung dopaminerger Neuronen nicht erforderlich ist.

Ziel dieser Studie ist es, diese Methode mit einem zuvor validierten viralen Vektor-basierten α-Syn-Rattenmodell der nigralen Neurodegeneration^8,9,10zu verifizieren. In diesem Modell wird die humane Mutante A53T α-syn im SNpc durch stereotaktische Injektion von Adeno-assoziiertem Virus-Hybrid-Serotyp 1/2 (AAV1/2) exprimiert, was zu einer signifikanten Neurodegeneration über einen Zeitraum von 6 Wochen führt. Das kontralaterale unausgestoßene SNpc kann in einigen Studien als interne Kontrolle für die injizierte Seite dienen. Häufiger wird die Injektion von AAV-Empty Vector (AAV-EV) in eine Kontrollkohorte von Tieren als Negativkontrolle verwendet. Wir präsentieren eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Abschätzung der Dichte dopaminerger Neuronen, die nach 6 Wochen im injizierten SNpc verbleiben, mit einer automatisierten Bildanalysesoftware (Abbildung 1).