Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)¹. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções transversais bidimensionais (2D) do tecido para estimar características volutivas nas estruturas tridimensionais (3D)^2,3,4. Os métodos eserológicos modernos baseados em design empregam procedimentos abrangentes de amostragem aleatória e aplicam protocolos de contagem (conhecidos como sondas) para evitar artefatos potenciais e erros sistemáticos, permitindo uma detecção confiável de diferenças apenas um pouco maior do que a variação inter-animal⁵. Embora a estereologia forneça uma poderosa ferramenta analítica para estudos histológicos in vivo, é tempo intensivo, assume a preparação uniforme de espécimes, e requer validação em várias etapas, o que pode impactar a eficiência cada vez mais necessária para a investigação translacional pré-clínica.

Os recentes avanços tecnológicos na ciência digital possibilitam a adoção de novas aplicações para avaliações mais eficientes da patologia sem um estereótipo, enquanto preenchem uma necessidade como substituto da estereologia imparcial. Esses métodos aumentam a velocidade, reduzem o erro humano e melhoram a reprodutibilidade das técnicas esteológicas^6,7. HALO é uma dessas plataformas de análise de imagem para análise quantitativa de tecidos em patologia digital. Ele compreende uma variedade de diferentes módulos e relata dados de expressão morfológica e multiplexado em uma base celular por célula em seções inteiras de tecido usando algoritmos de reconhecimento de padrões. O módulo FL citonuclear mede a positividade imunofluorescente de marcadores fluorescentes no núcleo ou citoplasma. Isso permite relatar o número de células positivas para cada marcador, e o escore de intensidade para cada célula. O módulo pode ser adaptado para fornecer tamanhos celulares individuais e medidas de intensidade, embora este recurso não seja necessário para quantificação de neurônios dopaminérgicos.

O objetivo deste estudo é verificar este método com um modelo de rato α-syn baseado em vetor viral previamente validado de neurodegeneração^{nigral 8,9,10}. Neste modelo, o mutante humano A53T α-syn é expresso no SNpc por injeção estereotática do sorotipo híbrido de vírus associado ao adeno 1/2 (AAV1/2), resultando em neurodegeneração significativa durante um período de 6 semanas. O SNpc não injetado contralateral pode, em alguns estudos, servir como um controle interno para o lado injetado. Mais comumente, a injeção de Vetor AAV-Empty (AAV-EV) em uma coorte de controle de animais é usada como um controle negativo. Apresentamos um guia passo-a-passo para estimar a densidade de neurônios dopaminérgicos remanescentes no SNpc injetado após 6 semanas usando um software automatizado de análise de imagem(Figura 1).