Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse
Summary
Hier presenteren we een geautomatiseerde methode voor semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neuron nummer in de rat substantia nigra pars compacta.
Abstract
Schatting van het aantal dopaminerge neuronen in de substantia nigra is een belangrijke methode in preklinisch onderzoek naar de ziekte van Parkinson. Momenteel is onbevooroordeeld stereologisch tellen de standaard voor kwantificering van deze cellen, maar het blijft een moeizaam en tijdrovend proces, dat misschien niet voor alle projecten haalbaar is. Hier beschrijven we het gebruik van een beeldanalyseplatform, dat de hoeveelheid gelabelde cellen in een vooraf gedefinieerde interesseregio nauwkeurig kan schatten. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor deze analysemethode in rattenhersenen en tonen aan dat het een significante vermindering van tyrosine hydroxylase positieve neuronen kan identificeren als gevolg van expressie van mutante α-synucleïne in de substantia nigra. We hebben deze methodologie gevalideerd door te vergelijken met resultaten verkregen door onbevooroordede stereologie. Samen biedt deze methode een tijdsefficiënt en nauwkeurig proces voor het detecteren van veranderingen in het aantal dopaminerge neuronen, en is dus geschikt voor efficiënte bepaling van het effect van interventies op de celoverleving.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een veel voorkomende neurodegeneratieve bewegingsstoornis die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van eiwitaggregaten die α-synucleïne (α-syn) bevatten en het voorkeursverlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc)1. Kwantificering van dopaminerge neuronen is een essentieel onderdeel van PD-onderzoek omdat het de evaluatie van de integriteit van het nigrostriatale systeem mogelijk maakt, waardoor het een belangrijk eindpunt is om de effectiviteit van potentiële ziekte-modificerende therapieën te beoordelen. Momenteel is de standaard voor kwantificering van celgetal onbevooroordeeld stereologisch tellen, dat tweedimensionale (2D) doorsneden van weefsel gebruikt om volumetrische kenmerken in driedimensionale (3D) structuren te schatten2,3,4. Moderne op ontwerpen gebaseerde stereologische methoden maken gebruik van uitgebreide steekproefprocedures en passen telprotocollen (bekend als sondes) toe om potentiële artefacten en systematische fouten te voorkomen, waardoor betrouwbare detectie van verschillen slechts iets groter is dan variatie tussen dieren5. Hoewel stereologie een krachtig analytisch instrument is voor in vivo histologische studies, is het tijdsintensief, veronderstelt het een uniforme monstervoorbereiding en vereist validatie in verschillende stappen, wat van invloed kan zijn op de efficiëntie die steeds meer nodig is voor preklinisch translationeel onderzoek.
Recente technologische vooruitgang in de digitale wetenschap maakt het mogelijk om nieuwe toepassingen aan te nemen voor efficiëntere beoordelingen van pathologie zonder een stereomicroscoop, terwijl het een behoefte vervult als surrogaat van onbevooroordede stereologie. Deze methoden verhogen de snelheid, verminderen menselijke fouten en verbeteren de reproduceerbaarheid van stereologische technieken6,7. HALO is zo’n beeldanalyseplatform voor kwantitatieve weefselanalyse in digitale pathologie. Het bestaat uit een verscheidenheid aan verschillende modules en rapporteert morfologische en multiplexed expressiegegevens per cel over hele weefselsecties met behulp van patroonherkenningsalgoritmen. De cytonucleaire FL-module meet de immunofluorescente positiviteit van fluorescerende markers in de kern of cytoplasma. Dit maakt het mogelijk om het aantal positieve cellen voor elke markering en de intensiteitsscore voor elke cel te rapporteren. De module kan worden aangepast om individuele celgroottes en intensiteitsmetingen te bieden, hoewel deze functie niet nodig is voor kwantificering van dopaminerge neuronen.
Het doel van deze studie is deze methode te verifiëren met een eerder gevalideerd viraal vectorgebaseerd α-syn rat model van nigrale neurodegeneratie8,9,10. In dit model wordt humaan mutant A53T α-syn uitgedrukt in de SNpc door stereotactische injectie van adeno-geassocieerd virus hybride serotype 1/2 (AAV1/2), resulterend in significante neurodegeneratie over een periode van 6 weken. De contralaterale niet-geïnjecteerde SNpc kan in sommige studies dienen als een interne controle voor de geïnjecteerde kant. Vaker wordt injectie van AAV-Empty Vector (AAV-EV) in een controlecohort van dieren gebruikt als een negatieve controle. We presenteren een stapsgewijze handleiding om de dichtheid van dopaminerge neuronen te schatten die na 6 weken in de geïnjecteerde SNpc achterblijven met behulp van een geautomatiseerde beeldanalysesoftware (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
De betrouwbare beoordeling van de integriteit van het dopaminerge systeem in preklinische modellen van PD is van cruciaal belang om de effectiviteit van potentiële ziektemodificerende therapieën te bepalen. Daarom is het belangrijk om potentiële verwarringen te beheersen en te minimaliseren die de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histopathologische gegevens kunnen verminderen. Zorgvuldige kwantitatieve uitkomsten kunnen meer informatie opleveren dan alleen kwalitatieve of semi-kwantitatieve beschrijvingen. T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen alle medewerkers van de Advanced Optical Microscopy Facility (AOMF) van het University Health Network bedanken voor hun tijd en hulp bij het ontwikkelen van dit protocol.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
