Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo del movimento neurodegenerativo prevalente caratterizzato dalla presenza di aggregati proteici contenenti α-sinuleina (α-syn) e dalla perdita preferenziale di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta (SNpc)¹. La quantificazione del numero di neuroni dopaminergici è una parte vitale della ricerca PD in quanto consente la valutazione dell’integrità del sistema nigrostriatale, fornendo così un endpoint importante per valutare l’efficacia delle potenziali terapie che modificano la malattia. Attualmente, lo standard per la quantificazione del numero di cellule è il conteggio stereologico imparziale, che utilizza sezioni trasversali bidimensionali (2D) del tessuto per stimare le caratteristiche volumetriche nelle strutture tridimensionali (3D)^2,3,4. I moderni metodi stereologici basati sulla progettazione utilizzano procedure di campionamento casuali complete e applicano protocolli di conteggio (noti come sonde) per evitare potenziali artefatti ed errori sistematici, consentendo un rilevamento affidabile delle differenze solo leggermente superiore alla variazione tra animali⁵. Mentre la stereologia fornisce un potente strumento analitico per studi istologici in vivo, richiede molto tempo, presuppone una preparazione uniforme del campione e richiede la convalida in diversi passaggi, il che può influire sull’efficienza sempre più richiesta per l’indagine traslazionale preclinale.

I recenti progressi tecnologici nella scienza digitale rendono possibile l’adozione di nuove applicazioni per valutazioni più efficienti della patologia senza stereomicroscopio, pur riempiendo un’esigenza di surrogato di stereologia imparziale. Questi metodi aumentano la velocità, riducono l’errore umano e migliorano la riproducibilità delle tecniche^{stereologiche 6,7}. HALO è una di queste piattaforme di analisi delle immagini per l’analisi quantitativa dei tessuti nella patologia digitale. Comprende una varietà di moduli diversi e riporta dati di espressione morfologici e multiplexati su base cellulare per cella su intere sezioni tissutali utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli. Il modulo FL citonucleare misura la positività immunofluorescente dei marcatori fluorescenti nel nucleo o nel citoplasma. Ciò consente di segnalare il numero di celle positive per ogni marcatore e il punteggio di intensità per ogni cella. Il modulo può essere adattato per fornire le singole dimensioni cellulari e le misurazioni dell’intensità, anche se questa caratteristica non è necessaria per la quantificazione dei neuroni dopaminergici.

Lo scopo di questo studio è quello di verificare questo metodo con un modello di ratto α-syn basato su vettori virali precedentemente convalidato di neurodegenerazione nigrale^8,9,10. In questo modello, il mutante umano A53T α-syn è espresso nell’SNpc per iniezione stereotassitica del sierotipo ibrido virus adeno-associato 1/2 (AAV1/2), con conseguente significativa neurodegenerazione per un periodo di 6 settimane. L’SNpc non iniettato contralaterale può, in alcuni studi, servire da controllo interno per il lato iniettato. Più comunemente, l’iniezione di vettore vuoto AAV (AAV-EV) in una coorte di controllo degli animali viene utilizzata come controllo negativo. Presentiamo una guida dettagliata per stimare la densità dei neuroni dopaminergici che rimangono nell’SNpc iniettato dopo 6 settimane utilizzando un software automatizzato di analisi delle immagini(Figura 1).