Полу количественное определение плотности дофаминергических нейронов в Чернии субстанции моделей грызунов с использованием автоматизированного анализа изображений

Болезнь Паркинсона (БП) является распространенным нейродегенеративным расстройством движения, характеризующимся наличием белковых агрегатов, содержащих α-синуклеин (α-син) и предпочтительной потерей дофаминергических нейронов в субстанции nigra pars compacta (SNpc)^1. Количественная оценка числа дофаминергических нейронов является жизненно важной частью исследования БП, поскольку она позволяет оценить целостность нигростриатальной системы, обеспечивая тем самым важную конечную точку для оценки эффективности потенциальных модифицирующих заболевание терапевтических средств. В настоящее время стандартом количественной оценки числа клеток является непредвзятый стереологический подсчет, который использует двумерные (2D) поперечные сечения ткани для оценки объемных особенностей в трехмерных (3D) структурах^2,3,4. Современные стереологические методы, основанные на проектировании, используют комплексные процедуры случайной выборки и применяют протоколы подсчета (известные как зонды), чтобы избежать потенциальных артефактов и систематических ошибок, что позволяет надежно обнаруживать различия, лишь немного большие, чем вариации между животными^5. Хотя стереология обеспечивает мощный аналитический инструмент для гистологических исследований in vivo, она занимает много времени, предполагает равномерную подготовку образца и требует валидации на нескольких этапах, что может повлиять на эффективность, все более необходимую для доклинического трансляционного исследования.

Последние технологические достижения в цифровой науке позволяют принимать новые приложения для более эффективной оценки патологии без стереомикроскопа, одновременно удовлетворяя потребность в качестве суррогата непредвзятой стереологии. Эти методы увеличивают скорость, уменьшают человеческую ошибку и улучшают воспроизводимость стереологических методов^6,7. HALO является одной из таких платформ анализа изображений для количественного анализа тканей в цифровой патологии. Он включает в себя множество различных модулей и сообщает морфологические и мультиплексированные данные экспрессии на клеточной основе по целым участкам ткани с использованием алгоритмов распознавания образов. Модуль cytonuclear FL измеряет иммунофлуоресцентную позитивность флуоресцентных маркеров в ядре или цитоплазме. Это позволяет сообщать о количестве клеток, положительных для каждого маркера, и оценке интенсивности для каждой ячейки. Модуль может быть адаптирован для обеспечения индивидуальных размеров клеток и измерений интенсивности, хотя эта функция не требуется для количественной оценки дофаминергических нейронов.

Целью данного исследования является проверка этого метода с помощью ранее проверенной вирусной векторной модели α-син крыс нигральной нейродегенерации^8,9,10. В этой модели человеческий мутант A53T α-syn экспрессируется в SNpc путем стереотаксической инъекции аденоассоциированного вируса гибридного серотипа 1/2 (AAV1/2), что приводит к значительной нейродегенерации в течение 6 недель. Контралатеральный неинъекционный SNpc может, в некоторых исследованиях, служить внутренним контролем для вводимой стороны. Чаще всего инъекция AAV-пустого вектора (AAV-EV) в контрольную когорту животных используется в качестве отрицательного контроля. Мы представляем пошаговое руководство по оценке плотности дофаминергических нейронов, оставшихся в введенном SNpc через 6 недель с использованием автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений(рисунок 1).