Determinación Semicuantita cuantitativa de la densidad de la neurona dopaminérgica en la sustancia negra de modelos de roedores utilizando el análisis automatizado de imágenes
Summary
Aquí presentamos un método automatizado para la determinación semicuantita cuantitativa del número de neuronas dopaminérgicas en el compacta de las igualdades del nigra del substantia de la rata.
Abstract
La estimación del número de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia es un método dominante en la investigación preclínica de la enfermedad de Parkinson. Actualmente, el conteo estereológico imparcial es el estándar para la cuantificación de estas células, pero sigue siendo un proceso laborioso y lento, que puede no ser factible para todos los proyectos. Aquí, describimos el uso de una plataforma de análisis de imágenes, que puede estimar con precisión la cantidad de celdas etiquetadas en una región predefinida de interés. Se describe un protocolo paso a paso para este método de análisis en el cerebro de rata y demostrar que puede identificar una reducción significativa en las neuronas positivas de la tirosina hidroxilasa debido a la expresión de mutante α-sinucleína en el nigra substantia. Se validó esta metodología mediante la comparación con los resultados obtenidos por estereología imparcial. En conjunto, este método proporciona un proceso eficiente en el tiempo y preciso para detectar cambios en el número de neuronas dopaminérgicas, y por lo tanto es adecuado para la determinación eficiente del efecto de las intervenciones en la supervivencia celular.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno del movimiento neurodegenerativo prevalente caracterizado por la presencia de agregados proteicos que contienen α-sinucleína (α-syn) y la pérdida preferencial de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra pars compacta (SNpc)1. La cuantificación del número de neuronas dopaminérgicas es una parte vital de la investigación de la EP, ya que permite la evaluación de la integridad del sistema nigroestriatal, lo que proporciona un criterio de valoración importante para evaluar la eficacia de la terapéutica potencial modificadora de la enfermedad. Actualmente, el estándar para la cuantificación del número celular es el conteo estereológico imparcial, que utiliza secciones transversales bidimensionales (2D) de tejido para estimar las características volumétricas en estructuras tridimensionales (3D)2,3,4. Los métodos estereológicos modernos basados en el diseño emplean procedimientos integrales de muestreo aleatorio y aplican protocolos de conteo (conocidos como sondas) para evitar artefactos potenciales y errores sistemáticos, lo que permite la detección confiable de diferencias sólo ligeramente mayores que la variación entre animales5. Si bien la estereología proporciona una poderosa herramienta analítica para los estudios histológicos in vivo, requiere mucho tiempo, asume una preparación uniforme de la muestra y requiere validación en varios pasos, lo que puede afectar la eficiencia cada vez más requerida para la investigación traslacional preclínica.
Los recientes avances tecnológicos en la ciencia digital permiten adoptar nuevas aplicaciones para evaluaciones más eficientes de la patología sin un estereomicroscopio, al tiempo que se llena una necesidad como sustituto de la estereología imparcial. Estos métodos aumentan la velocidad, reducen el error humano y mejoran la reproducibilidad de las técnicas estereológicas6,7. HALO es una de esas plataformas de análisis de imágenes para el análisis cuantitativo de tejidos en patología digital. Comprende una variedad de diferentes módulos e informes de expresión morfológica y multiplexada datos sobre una base de célula por célula a través de secciones de tejido entero utilizando algoritmos de reconocimiento de patrones. El módulo citonuclear FL mide la positividad inmunofluorescente de los marcadores fluorescentes en el núcleo o citoplasma. Esto permite informar del número de celdas positivas para cada marcador y la puntuación de intensidad para cada celda. El módulo se puede adaptar para proporcionar tamaños de célula individuales y mediciones de intensidad, aunque esta característica no es necesaria para la cuantificación de las neuronas dopaminérgicas.
El objetivo de este estudio es verificar este método con un modelo de neurodegeneración nigral previamente validado basado en vectores α-syn de neurodegeneraciónnigral 8,9,10. En este modelo, el mutante humano A53T α-syn se expresa en el SNpc por inyección estereotáctica del serotipo híbrido de virus adenoasociado 1/2 (AAV1/2), lo que resulta en una neurodegeneración significativa durante un período de 6 semanas. El SNpc no inyectado contralateral puede, en algunos estudios, servir como un control interno para el lado inyectado. Más comúnmente, la inyección de AAV-Empty Vector (AAV-EV) en una cohorte de control de animales se utiliza como un control negativo. Presentamos una guía paso a paso para estimar la densidad de neuronas dopaminérgicas que permanecen en el SNpc inyectado después de 6 semanas utilizando un software de análisis de imágenes automatizado(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La evaluación confiable de la integridad del sistema dopaminérgico en modelos preclínicos del paladio es crítica determinar la eficacia de la terapéutica enfermedad-que modifica potencial. Por lo tanto, es importante controlar y minimizar las posibles confundciones que pueden reducir la fiabilidad y reproducibilidad de los datos histopatológicos. Los resultados cuantitativos cuidadosos pueden proporcionar más información que las descripciones cualitativas o semicuantitaticas por sí solas. Al mismo tiempo, debemo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a todo el personal del Centro de Microscopía Óptica Avanzada (AOMF) de university health network por su tiempo y asistencia en el desarrollo de este protocolo.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
