自動画像解析を用いたげっ歯類モデルのサブスタチングニグラにおけるドーパミン作動性ニューロン密度の半定量的決定
Summary
ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。
Abstract
立体ニグラにおけるドーパミン作動性ニューロンの数の推定は、前臨床パーキンソン病研究における重要な方法である。現在、公平な立体的なカウントは、これらの細胞の定量化のための標準ですが、それは、すべてのプロジェクトのために実現可能ではないかもしれない、面倒で時間のかかるプロセスのままです。ここでは、あらかじめ定義された対象領域におけるラベル付き細胞の量を正確に推定できる画像解析プラットフォームの使用について説明する。我々は、ラット脳におけるこの分析方法のステップバイステップのプロトコルを説明し、実質的なニグラにおける変異型αシヌクレインの発現によるチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンの有意な減少を同定できることを実証する。我々は、この方法論を、公平なステレロジーによって得られた結果と比較することによって検証した。この方法を組み合わせると、ドーパミン作動性ニューロン数の変化を検出するための時間効率と正確なプロセスを提供し、したがって、細胞生存に対する介入の効果を効率的に決定するのに適している。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、α-シヌクレイン(α-syn)を含むタンパク質凝集体の存在と、実質的なニグラパルス・パルス・スプカ(SNpc)におけるドーパミン作動性ニューロンの優等喪失を特徴とする一般的な神経変性運動障害である。ドーパミン作動性ニューロン数の定量化は、結合トリアティアル系の完全性の評価を可能にするため、PD研究の重要な部分であり、したがって、潜在的な疾患修飾療法の有効性を評価する重要なエンドポイントを提供する。現在、細胞数の定量化基準は、組織の2次元(2D)断面を利用して、3次元(3D)構造における容積物特徴を2、3、4に推定する非バイアス的な立体数計数である。現代の設計ベースのステレオロジー手法は、包括的なランダムサンプリング手順を採用し、潜在的なアーティファクトと系統的エラーを回避するためにカウントプロトコル(プローブと呼ばれる)を適用し、動物間変動5よりもわずかに大きい差の信頼性の高い検出を可能にする。ステテロロジーは生体組織学的研究のための強力な分析ツールを提供するが、それは時間のかかる、均一な標本の準備を前提とし、臨床前の翻訳調査にますます必要とされる効率に影響を与えることができるいくつかのステップで検証を必要とします。
デジタル科学の最近の技術進歩により、非偏型ステレロジーの代理としての必要性を満たしながら、実体顕微鏡なしで病理学のより効率的な評価のための新しいアプリケーションを採用することが可能になりました。これらの方法は、速度を向上させ、人為的ミスを減らし、立体技術6,7の再現性を向上させる。HALOは、デジタル病理における定量的組織分析用の画像解析プラットフォームの1つです。それはさまざまなモジュールで構成され、パターン認識アルゴリズムを使用して組織のセクション全体の細胞ごとに形態学的および多重化された発現データを報告する。細胞核FLモジュールは、核または細胞質中の蛍光マーカーの免疫蛍光陽性を測定する。これにより、各マーカーの正のセル数と、各セルの強度スコアを報告できます。このモジュールは、個々の細胞サイズおよび強度測定を提供するように適合することができるが、この特徴はドーパミン作動性ニューロンの定量化に必要ではない。
本研究の目的は、ニグラル神経変性8、9、10の以前に検証されたウイルスベクターベースのα-synラットモデルを用いてこの方法を検証することである。このモデルでは、ヒト変異体A53T α-synは、アデノ関連ウイルスハイブリッド血清型1/2(AAV1/2)の立体的注射によりSNpcで発現し、6週間にわたって有意な神経変性をもたらす。逆側未注入SNpcは、いくつかの研究において、注入された側の内部統制として役立つかもしれない。より一般的には、動物のコントロールコホートにおけるAAV-空ベクトル(AAV-EV)の注入は、陰性対照として使用される。自動画像解析ソフトウェアを使用して、注入されたSNpcに残っているドーパミン作動性ニューロンの密度を6週間後に推定するためのステップバイステップガイドを提示する(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDの前臨床モデルにおけるドーパミン作動系の完全性の信頼性の高い評価は、潜在的な疾患修飾療法の有効性を決定するために重要である。したがって、組織病理学的データの信頼性と再現性を低下させる可能性のある交点を制御し、最小限に抑えることが重要です。慎重な定量的結果は、定性的または半定量的な記述だけではより多くの情報を提供することができます。同時に、時間と資?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、大学保健ネットワークの先端光学顕微鏡施設(AOMF)のスタッフの皆さんに、このプロトコルの開発に時間と支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
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