קביעה כמותית למחצה של צפיפות נוירון דופאמין בסבסטנציה ניגרה של מודלים מכרסמים באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי
Summary
כאן אנו מציגים שיטה אוטומטית לקביעה כמותית למחצה של מספר נוירון דופאמין בסובסטנציה חולדה nigra pars compacta.
Abstract
הערכה של מספר נוירונים דופאמין הסובסטנציה ניגרה היא שיטה מרכזית במחקר טרום קליני מחלת פרקינסון. נכון לעכשיו, ספירה סטריאולוגית לא משוחדת היא התקן לכימות של תאים אלה, אך היא נשארת תהליך מייגע וגוזל זמן רב, אשר לא יכול להיות ריאלי עבור כל הפרויקטים. כאן, אנו מתארים את השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה, אשר יכולה להעריך במדויק את כמות התאים המסומנים באזור מוגדר מראש של עניין. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לשיטת ניתוח זו במוח החולדה ומדגימים שהוא יכול לזהות ירידה משמעותית בנוירונים חיוביים טירוסין הידרוקסילאז עקב ביטוי של מוטציה α-סינוקלאין בסובסטיה ניגרה. אימתנו מתודולוגיה זו על ידי השוואה עם תוצאות שהושגו על ידי סטריאולוגיה משוחדת. יחד, שיטה זו מספקת תהליך יעיל ומדויק לגילוי שינויים במספר נוירון דופאמין, ולכן מתאים לקביעה יעילה של ההשפעה של התערבויות על הישרדות התא.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעת תנועה נוירודגנרטיבית נפוצה המאופיינת על ידי נוכחות של אגרגטים חלבון המכיל α-synuclein (α-syn) ואת האובדן המועדף של נוירונים דופאמין הסובסטנציה ניגרה pars compacta (SNpc)1. כימות של מספר נוירון דופאמין הוא חלק חיוני של מחקר PD כפי שהוא מאפשר את ההערכה של השלמות של המערכת nigrostriatal, ובכך, מתן נקודת קצה חשובה כדי להעריך את האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים שינוי המחלה. נכון לעכשיו, התקן לכימות מספר תא הוא ספירה סטריאולוגית לא משוחדת, המשתמשת ב חתכים דו מימדיים (2D) של רקמה כדי להעריך תכונות נפחיות במבנים תלת מימדיים (3D)2,3,4. שיטות סטריאולוגיות מבוססות עיצוב מודרניות משתמשות בהליכי דגימה אקראיים מקיפים ומיישמות פרוטוקולי ספירה (הידועים כבדיקות) כדי למנוע חפצים פוטנציאליים ושגיאות שיטתיות, המאפשרים זיהוי אמין של הבדלים רק מעט יותר מאשר וריאציה בין בעליחיים 5. בעוד סטריאולוגיה מספקת כלי אנליטי רב עוצמה למחקרים היסטולוגיים in vivo, זה זמן אינטנסיבי, מניח הכנת דגימה אחידה, ודורש אימות במספר שלבים, אשר יכול להשפיע על היעילות הנדרשת יותר ויותר עבור חקירה תרגום פרה קליני.
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה במדע הדיגיטלי מאפשרת לאמץ יישומים חדשניים להערכות יעילות יותר של פתולוגיה ללא סטריאומיקרוסקופ, תוך מילוי הצורך כפונדקאי של סטריאולוגיה לא משוחדת. שיטות אלה להגביר את המהירות, להפחית את השגיאה האנושית, ולשפר את הרבייה של טכניקות סטריאולוגיות6,7. HALO היא פלטפורמה כזו לניתוח תמונה לניתוח רקמות כמותיות בפתולוגיה דיגיטלית. הוא מורכב ממגוון מודולים שונים ומדווח על נתוני ביטוי מורפולוגיים ומולטי-אקסים על בסיס תא אחר תא על פני מקטעי רקמות שלמים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי תבניות. מודול ה-FL הציטונוקלארי מודד את החיוביות האימונופלואורסצנטית של סמנים פלואורסצנטיים בגרעין או בציטופלסמה. הדבר מאפשר דיווח על מספר התאים החיוביים עבור כל סמן ועל ציון העוצמה עבור כל תא. המודול יכול להיות מותאם כדי לספק גדלי תאים בודדים ומדידות אינטנסיביות, אם כי תכונה זו אינה נדרשת לכימות של נוירונים דופאמין.
מטרת מחקר זה היא לאמת שיטה זו עם מודל חולדה α-syn וקטורי מאומת בעבר של ניוון עצבי ניגרל8,9,10. במודל זה, מוטציה אנושית A53T α-syn באה לידי ביטוי SNpc על ידי הזרקה סטראוטקטית של סרוטיפ היברידי וירוס הקשורים אדנו 1/2 (AAV1/2), וכתוצאה מכך ניוון עצבי משמעותי על פני תקופה של 6 שבועות. SNpc uninjected התווית עשוי, במחקרים מסוימים, לשמש שליטה פנימית עבור הצד מוזרק. בדרך כלל, הזרקת וקטור AAV-ריק (AAV-EV) בקבוצת שליטה של בעלי חיים משמש כפקד שלילי. אנו מציגים מדריך שלב אחר שלב להערכת הצפיפות של נוירונים דופאמין שנותרו SNpc מוזרק לאחר 6 שבועות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
ההערכה האמינה של שלמות המערכת הדופאמינרגית במודלים פרה-קליניים של PD היא קריטית כדי לקבוע את האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים לשינוי מחלות. לכן, חשוב לשלוט ולמזער מבלבלים פוטנציאליים שעשויים להפחית את האמינות והשחזור של נתונים היסטופטולוגיים. תוצאות כמותיות זהירות יכולות לספק מידע רב י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לכל הצוות במתקן מיקרוסקופיה אופטי מתקדם (AOMF) ברשת הבריאות האוניברסיטאית על זמנם וסיוע בפיתוח פרוטוקול זה.
Materials
| A-Syn Antibody | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| Biotinylated anti-mouse IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| DAKO fluorescent mouting medium | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| NeuN Antibody | Millipore | MAB377 | |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT | Tissue-Tek | ||
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.1 | |
| Sliding microtome | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| Sucrose | BioShop | SUC700 | |
| TH Antibody | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount mounting medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black Software | Zeiss | ||
| Zen Blue Software | Zeiss |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson’s disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Nair-Roberts, R. G., et al. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Golub, V. M., et al. Neurostereology protocol for unbiased quantification of neuronal injury and neurodegeneration. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 196 (2015).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
- Penttinen, A. M., et al. Implementation of deep neural networks to count dopamine neurons in substantia nigra. European Journal of Neuroscience. 48 (6), 2354-2361 (2018).
- Yousef, A., et al. Neuron loss and degeneration in the progression of TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 68 (2017).
- Koprich, J. B., et al. Expression of human A53T alpha-synuclein in the rat substantia nigra using a novel AAV1/2 vector produces a rapidly evolving pathology with protein aggregation, dystrophic neurite architecture and nigrostriatal degeneration with potential to model the pathology of Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 5, 43 (2010).
- Koprich, J. B., et al. Progressive neurodegeneration or endogenous compensation in an animal model of Parkinson’s disease produced by decreasing doses of alpha-synuclein. PLoS One. 6 (3), 17698 (2011).
- McKinnon, C., et al. Early-onset impairment of the ubiquitin-proteasome system in dopaminergic neurons caused by alpha-synuclein. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 17 (2020).
- Henderson, M. X., et al. Spread of alpha-synuclein pathology through the brain connectome is modulated by selective vulnerability and predicted by network analysis. Nature Neuroscience. 22 (8), 1248-1257 (2019).
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 11 (2017).
- Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
