Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Según datos de la Organización Mundial de la Salud, alrededor de 5,5 millones de personas mueren cada año a causa del accidente cerebrovascular isquémico¹. Esta condición se caracteriza por la interrupción del flujo sanguíneo a una determinada región cerebral, lo que resulta en una pérdida reversible o irreversible en el suministro de oxígeno y nutrientes al tejido, que altera la función tisular y conduce a la disfunción mitocondrial, desregulación del calcio, excitotoxicidad glutamato, inflamación y pérdida celular^2,,3.

Aparte de las células vasculares, las células neuronales y gliales están involucradas en la fisiopatología del accidente cerebrovascular isquémico^4. En particular, los astrocitos son esenciales para el mantenimiento de las neuronas y recientemente se demostró que desempeñan un papel crítico en la respuesta a la lesión isquémica^5. Este tipo de célula glial realiza funciones de soporte estructural, defensa contra el estrés oxidativo, síntesis de neurotransmisores, estabilización de la comunicación célula-célula, entre otros⁶. Junto con las neuronas, los astrocitos juegan un papel directo en la transmisión sináptica, regulando la liberación de moléculas como el trifosfato de adenosina, el ácido gamma-aminobutírico y el glutamato^7. Parte de la lesión inducida por la isquemia es causada por la liberación excesiva de glutamato y su acumulación en la hendidura sináptica, lo que conduce a la desactivación excesiva de los receptores de N-metil-D-aspartato, activando cascadas de señalización aguas abajo, resultando en última instancia en excitotoxicidad⁸. Dado que los astrocitos son capaces de eliminar el glutamato de la hendidura sináptica y convertirlo en glutamina, son cruciales en la defensa contra la excitotoxicidad, ejerciendo así un efecto neuroprotector sobre la isquemia. Estas células también juegan un papel en la neuroinflamación inducida por isquemia. Después del insulto isquémico, los astrocitos activados sufren cambios morfológicos (hipertrofia), proliferan y muestran un aumento en la expresión de la proteína ácida fibribrinaria glial (GFAP). Pueden volverse reactivas (astrogliosis), liberando citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral-α, interleucina-1 e interleucina-1o, y produciendo radicales libres, incluyendo óxido nítrico y superóxido, que a su vez pueden inducir la muerte neuronal^9,,10. Por el contrario, los astrocitos reactivos también pueden reproducir un efecto neuroprotector, ya que liberan citoquinas antiinflamatorias, como la transformación del factor de crecimiento β, que se regula al al al ras detrás del accidente^{cerebrovascular 11.} Además, pueden generar una cicatriz glial, que puede limitar la regeneración tisular mediante la inhibición de la brotación axonal; sin embargo, esta cicatriz glial puede aislar el sitio de la lesión del tejido viable, evitando así una onda en cascada de daño tisular incontrolado^12,13.

Por lo tanto, es imperativo establecer modelos que permitan estudiar las interacciones de la neurona-glia bajo una lesión isquémica con el fin de encontrar estrategias terapéuticas que limiten o reviertan los efectos de la lesión isquémica. En comparación con otros modelos utilizados para estudiar lesiones isquémicas, a saber, los modelos in vivo ^14,15,16, cultivos organotípicos^17,18,19 y rebanadas cerebrales agudas^20,21,22, cultivos de células primarias son menos complejos, lo que hace posible el estudio de las contribuciones individuales de cada tipo de célula en la fisiopatología de los accidentes cerebrovasculares isquémicos y cómo cada tipo de célula responde posible a las metas terapéuticas posibles. Típicamente, con el fin de estudiar las interacciones entre cultivos enriquecidos con neuronas y cultivos enriquecidos con astrocitos, las neuronas y células gliales de origen posnatal se utilizan^23,,24, o células gliales postnatales y neuronas embrionarias^25,,26. Aquí se propone un enfoque simple para establecer cultivos enriquecidos con neuronas o astrocitos y cultivos de neurona-glia del mismo tejido. Estas células primarias se obtienen de corteza embrionaria de rata, una región frecuentemente afectada por el accidente cerebrovascular^27,,28. Además, la disociación del tejido se realiza sólo mediante un procedimiento mecánico. Por lo tanto, este protocolo permite aislar las células en la misma etapa de desarrollo, de una manera rápida y económica, y con alto rendimiento y reproducibilidad.

La conversación cruzada entre astrocitos y neuronas se puede explorar utilizando un sistema de co-cultivo en el que las neuronas cultivadas en cubreobjetos se mantienen en contacto con una monocapa de astrocitos sembrados en placas multipocillos. Se pueden utilizar pequeñas esferas de parafina para garantizar la separación de los dos cultivos celulares. Este enfoque permite la manipulación independiente de cada tipo de celda antes de que se entren en contacto. Por ejemplo, es posible silenciar un gen específico en los astrocitos y ver cómo puede influir en la vulnerabilidad neuronal o la protección contra el daño inducido por isquémica. Un método establecido para inducir condiciones isquémicas in vitro es la privación de oxígeno y glucosa (OGD)³, que consiste en reemplazar la atmósfera regular (95% aire y 5% CO₂₎por una atmósfera anóxica (95% N₂ y 5% CO₂), asociada con la omisión de glucosa.

El método descrito es adecuado para estudiar las interacciones entre neuronas y astrocitos en el contexto del accidente cerebrovascular isquémico, de una manera simple, rápida, reproducible y económica.