Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Volgens gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie sterven jaarlijks ongeveer 5,5 miljoen mensen aan ischemische beroerte^1. Deze aandoening wordt gekenmerkt door de onderbreking van de bloedtoevoer naar een bepaald hersengebied, wat resulteert in een omkeerbaar of onomkeerbaar verlies in de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar het weefsel, wat de weefselfunctie verandert en leidt tot mitochondriale disfunctie, calciumdysregulatie, glutamaat excitotoxiciteit, ontsteking en celverlies^2,3.

Afgezien van vasculaire cellen, neuronale en gliacellen zijn betrokken bij de pathofysiologie van de ischemische beroerte⁴. In het bijzonder, astrocyten zijn essentieel voor het onderhoud van neuronen en onlangs bleek een cruciale rol te spelen in de reactie op de ischemische laesie⁵. Dit type gliacel vervult functies van structurele ondersteuning, verdediging tegen oxidatieve stress, synthese van neurotransmitters, stabilisatie van celcelcommunicatie, onder andere⁶. Samen met neuronen, astrocyten spelen een directe rol in synaptische transmissie, het reguleren van de afgifte van moleculen zoals adenosine triphosfat, gamma-aminoboterzuur en glutamaat⁷. Een deel van de schade veroorzaakt door ischemie wordt veroorzaakt door de overmatige afgifte van glutamaat en de accumulatie ervan op de synaptische kloof, wat leidt tot de overactivatie van N-methyl-D-aspartaatreceptoren, het activeren van downstream signaalcascades, wat uiteindelijk resulteert in excitotoxiciteit⁸. Aangezien astrocyten glutamaat uit de synaptische kloof kunnen verwijderen en omzetten in glutamine, zijn ze cruciaal in het verdedigen tegen excitotoxiciteit, waardoor een neuroprotectief effect op ischemie wordt uitgeoefend. Deze cellen spelen ook een rol in ischemie-geïnduceerde neuro-ontsteking. Na de ischemische belediging ondergaan geactiveerde astrocyten morfologische veranderingen (hypertrofie), vermenigvuldigen, en tonen een toename van de gliafibrillaire zure eiwit (GFAP) expressie. Ze kunnen reactief worden (astroglise), het vrijgeven van pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrose factor-α, interleukine-1α en interleukine-1β, en het produceren van vrije radicalen, waaronder stikstofmonoxide en superoxide, die op hun beurt kan leiden tot neuronale dood^9,10. In tegenstelling, reactieve astrocyten kunnen ook een neuroprotectief effect spelen, omdat ze ontstekingsremmende cytokinen afgeven, zoals het transformeren van groeifactor-β, die na beroerte¹¹upgereguleerd is. Bovendien kunnen ze een glialitteken genereren, dat weefselregeneratie kan beperken door het remmen van axonale kiemen; dit glialitteken kan echter de letselplaats isoleren van levensvatbaar weefsel, waardoor een trapsgewijze golf van ongecontroleerde weefselschade^12,13wordt voorkomen .

Zo is het noodzakelijk om modellen vast te stellen die het mogelijk maken het bestuderen van neuron-glia interacties onder een ischemische schade om therapeutische strategieën die beperken of omkeren van de effecten van ischemische letsel te vinden. In vergelijking met andere modellen die worden gebruikt om ischemische letsel te bestuderen, namelijk in vivo modellen^14,15,16, organotypic culturen^17,18,19 en acute hersenschijfjes^20,21,22, primaire celculturen zijn minder complex, waardoor de studie van individuele bijdragen van elk celtype in de pathofysiologie van ischemische beroerte en hoe elk celtype reageert op mogelijke therapeutische doelen mogelijk maakt. Typisch, om de interacties tussen neuron-verrijkte culturen en astrocyten verrijkte culturen te bestuderen, neuronen en gliacellen van postnatale oorsprong worden gebruikt^23,,24, of postnatale gliacellen en embryonale neuronen^25,26. Hierin wordt voorgesteld een eenvoudige aanpak om neuron- of astrocyten verrijkte culturen en neuron-glia culturen vast te stellen uit hetzelfde weefsel. Deze primaire cellen worden verkregen uit rat embryonale cortex, een gebied vaak beïnvloed door beroerte^27,28. Bovendien wordt de dissociatie van het weefsel alleen uitgevoerd door een mechanische procedure. Daarom maakt dit protocol het isoleren van cellen in dezelfde ontwikkelingsfase mogelijk, op een snelle en goedkope manier, en met hoge prestaties en reproduceerbaarheid.

De crosstalk tussen astrocyten en neuronen kan worden onderzocht met behulp van een co-cultuur systeem waarin neuronen gekweekt in coverslips worden onderhouden in contact met een monolaag van astrocyten gezaaid in multiwell platen. Kleine paraffinebollen kunnen worden gebruikt om de scheiding van de twee celculturen te garanderen. Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie van elk celtype mogelijk voordat ze in contact worden gebracht. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een specifiek gen in astrocyten het zwijgen op te leggen en te zien hoe het de neuronale kwetsbaarheid of bescherming tegen ischemische schade kan beïnvloeden. Een gevestigde methode om ischemische omstandigheden in vitro te induceren is zuurstof- en glucosedeprivatie (OGD)³, die bestaat in het vervangen van de reguliere atmosfeer (95% lucht en 5% CO₂₎door een anoxische atmosfeer (95% N₂ en 5% CO₂), geassocieerd met het weglaten van glucose.

De beschreven methode is geschikt voor het bestuderen van de interacties tussen neuronen en astrocyten in de context van ischemische beroerte, op een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en goedkope manier.