Модель клеточной культуры для изучения роли взаимодействия нейронов и глий в ишемии

По данным Всемирной организации здравоохранения, около 5,5 миллионов человек умирают каждый год от ишемического инсульта¹. Это условие характеризуется прерыванием притока крови к определенной области мозга, что приводит к обратимой или необратимой потере в поставках кислорода и питательных веществ в ткани, что изменяет функцию тканей и приводит к митохондриальной дисфункции, дисрегуляции кальция, глутаматной акутотоксичности, воспалению^{и потере клеток 2,3}.

Помимо сосудистых клеток, в патофизиологии ишемического инсульта 4 участвуют нейрональные и глиальные^{клетки.} В частности, астроциты имеют важное значение для поддержания нейронов и в последнее время было показано, играют важную роль в ответ на ишемическое^{поражение 5}. Этот тип глиальных клеток выполняет функции структурной поддержки, защиты от окислительного стресса, синтеза нейротрансмиттеров, стабилизации клеточной связи, среди^{прочих 6.} Наряду с нейронами, астроциты играют непосредственную роль в синаптической передаче, регулируя высвобождение молекул, таких как аденозинтрифосфат, гамма-аминомасляная кислота и^{глутамат 7}. Часть травмы, вызванной ишемией, вызвана чрезмерным высвобождением глутамата и его накоплением в синаптической расщелине, что приводит к чрезмерной активации N-метил-D-аспаратных рецепторов, активируя вниз по течению сигнальные каскады, что в конечном итоге приводит к возбуждению⁸. Так как астроциты способны удалить глутамат из синаптической расщелины и преобразовать его в глутамин, они имеют решающее значение в защите от возбудимости, тем самым оказывая нейропротекторное воздействие на ишемию. Эти клетки также играют роль в ишемии индуцированной нейровоспламенения. После ишемического оскорбления активированные астроциты претерпевает морфологические изменения (гипертрофия), размножаются и показывают увеличение экспрессии глиального фибриллярного кислотного белка (GFAP). Они могут стать реактивными (астроглиоз), выпуская провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1 и интерлейкин-1 “, и производство свободных радикалов, в том числе оксида азота и супероксида, который, в свою очередь, может^{вызвать нейронной смерти 9,10}. В отличие от этого, реактивные астроциты могут также играть нейропротекторный эффект, так как они выпускают противовоспалительные цитокины, такие как преобразование фактора роста-β, который регулируется после^{инсульта 11}. Кроме того, они могут генерировать глиальный шрам, который может ограничить регенерацию тканей путем ингибирования прорастания аксонала; однако, этот глиальный шрам может изолировать место травмы от жизнеспособной ткани, тем самым предотвращая каскадную волну неконтролируемого^{повреждения тканей 12,13}.

Таким образом, необходимо создать модели, которые позволяют изучать взаимодействия нейронов и глии под ишемической травмой, чтобы найти терапевтические стратегии, которые ограничивают или обратить вспять последствия ишемической травмы. По сравнению с другими моделями, используемыми для изучения ишемической травмы, а именно in vivo ^{модели 14,,15,,16,}органотипические^{культуры 17,,18,,19} и^{острые ломтики мозга 20,,21,}22 ,^{первичные клеточные}культуры менее сложны, что делает возможным изучение индивидуального вклада каждого типа клеток в патофизиологии ишемического инсульта и как каждый тип клеток реагирует на возможные цели. Как правило, для изучения взаимодействий между обогащенными нейронами культурами и обогащенными астроцитами культурами используются нейроны и^{глиальные клетки послеродового происхождения 23, 24,24}, или послеродовые глиальные клетки и эмбриональные^{нейроны 25,26}. В этом предлагается простой подход к созданию нейронов или астроцитов обогащенных культур и нейронов-глии культур из той же ткани. Эти первичные клетки получены из эмбриональной коры крысы, области, часто пострадавших от^{инсульта 27,28}. Более того, диссоциация ткани осуществляется только механической процедурой. Таким образом, этот протокол позволяет изолировать клетки на той же стадии развития, быстрым и недорогим способом, и с высокой производительностью и воспроизводимостью.

Перекрестный разговор между астроцитами и нейронами может быть исследован с помощью системы совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, посеянных в многоувелицевых пластин. Малые парафиновые сферы могут быть использованы для обеспечения разделения двух клеточных культур. Такой подход позволяет самостоятельно манипулировать каждым типом ячейки, прежде чем они ввяжут. Например, можно заставить замолчать определенный ген в астроцитах и посмотреть, как он может повлиять на уязвимость нейронов или защиту от ишемического повреждения. Установленным методом индуцирования ишемических условий in vitro является лишение кислорода и глюкозы (OGD)³, который состоит в замене обычной атмосферы (95% воздуха и 5% CO₂₎аноксической атмосферой (95% N₂ и 5% CO_2),связанной с упущением глюкозы.

Описанный метод подходит для изучения взаимодействий между нейронами и астроцитами в контексте ишемического инсульта простым, быстрым, воспроизводимым и недорогим способом.