Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Secondo i dati dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, circa 5,5 milioni di persone muoiono ogni anno a causa di un ictus ischemico¹. Questa condizione è caratterizzata dall’interruzione del flusso sanguigno in una determinata regione del cervello, con conseguente perdita reversibile o irreversibile nell’apporto di ossigeno e sostanze nutritive al tessuto, che altera la funzione del tessuto e porta a disfunzione mitocondriale, disregolazione del calcio, ecitotossicità del glutammato, infiammazione e perdita cellulare^2,3.

Oltre alle cellule vascolari, le cellule neuronali e gliali sono coinvolte nella fisiofisiologia dell’ictus ischemico⁴. In particolare, gli astrociti sono essenziali per il mantenimento dei neuroni e recentemente hanno dimostrato di svolgere un ruolo critico nella risposta alla lesione ischemica⁵. Questo tipo di cellula gliale svolge funzioni di supporto strutturale, difesa contro lo stress ossidativo, sintesi di neurotrasmettitori, stabilizzazione della comunicazione cellulare-cellula, tra gli altri⁶. Insieme ai neuroni, gli astrociti svolgono un ruolo diretto nella trasmissione sinaptica, regolando il rilascio di molecole come l’adenosina triphosfato, l’acido gamma-aminobutyrico e il glutammato⁷. Parte della lesione indotta dall’ischemia è causata dall’eccessivo rilascio di glutammato e dal suo accumulo alla fessura sinaptica, che porta all’eccessiva attivazione dei recettori N-methyl-D-aspartate, attivando le cascate di segnalazione a valle, con conseguente ecitotossicità⁸. Poiché gli astrociti sono in grado di rimuovere il glutammato dalla fessura sinaptica e convertirlo in glutammina, sono fondamentali per difendersi dall’eccitatossicità, esercitando così un effetto neuroprotettivo sull’ischemia. Queste cellule svolgono anche un ruolo nella neuroinfiammazione indotta da ischemia. Dopo l’insulto ischemico, gli astrociti attivati subiscono cambiamenti morfologici (ipertrofia), proliferano e mostrano un aumento dell’espressione della proteina acida fibrillale gliale (GFAP). Possono diventare reattivi (astrogliosi), rilasciando citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-α, l’interleuchina-1 e l’interleuchina-1β, e producendo radicali liberi, tra cui ossido nitrico e superossido, che a sua volta possono indurre la morte neuronale^9,10. Al contrario, gli astrociti reattivi possono anche svolgere un effetto neuroprotettivo, poiché rilasciano citochine antinfiammatorie, come trasformare il fattore di crescita-β, che viene regolato dopo^{l’ictus 11}. Inoltre, possono generare una cicatrice gliale, che può limitare la rigenerazione dei tessuti inibendo la germogliazione assonale; tuttavia, questa cicatrice gliale può isolare il sito di lesione dal tessuto vitale, impedendo così un’ondata a cascata di danni ai tessuti^{incontrollati 12,13}.

Pertanto, è imperativo stabilire modelli che consentano di studiare le interazioni neurone-glia sotto una lesione ischemica al fine di trovare strategie terapeutiche che limitino o inverodino gli effetti della lesione ischemica. Rispetto ad altri modelli utilizzati per studiare le lesioni ischemiche, vale a dire i modelli in vivo ^14,15,16, le colture organotipiche^17,18,19 e le fette cerebrali acute^20,21^,22, le colture cellulari primarie sono meno complesse, il che rende possibile lo studio dei singoli contributi di ogni tipo di cellula nella fisiofisiologia dell’ictus ischemico e come ogni tipo di cellula risponde a possibili bersagli terapeutici.²² Tipicamente, al fine di studiare le interazioni tra colture arricchite di neuroni e colture arricchite di astrociti, i neuroni e le cellule gliali di origine postnatale vengono^{utilizzati 23,24}, o cellule gliali postnatali e neuroni embrionali^25,26. Qui viene proposto un approccio semplice per stabilire colture arricchite di neuroni o astrociti e colture neurone-glia dallo stesso tessuto. Queste cellule primarie sono ottenute dalla corteccia embrionale del ratto, una regione spesso colpita^{dall’ictus 27,28}. Inoltre, la dissociazione del tessuto viene eseguita solo con una procedura meccanica. Pertanto, questo protocollo consente di isolare le cellule nella stessa fase di sviluppo, in modo rapido ed economico e con elevate prestazioni e riproducibilità.

L’incrocio tra astrociti e neuroni può essere esplorato utilizzando un sistema di co-coltura in cui i neuroni colturati in co-lips sono mantenuti a contatto con un monostrato di astrociti semi di placche multiwell. Piccole sfere di paraffina possono essere utilizzate per garantire la separazione delle due colture cellulari. Questo approccio consente la manipolazione indipendente di ogni tipo di cella prima che siano portati in contatto. Ad esempio, è possibile silenziare un gene specifico negli astrociti e vedere come può influenzare la vulnerabilità neuronale o la protezione contro i danni indotta dall’ischemia. Un metodo consolidato per indurre condizioni ischemiche in vitro è la privazione di ossigeno e glucosio (OGD)³, che consiste nel sostituire l’atmosfera regolare (95% aria e 5% CO₂) da un’atmosfera anossica (95% N₂ e 5% CO₂), associata all’omissione di glucosio.

Il metodo descritto è adatto per studiare le interazioni tra neuroni e astrociti nel contesto dell’ictus ischemico, in modo semplice, veloce, riproducibile ed economico.