Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sterben jedes Jahr etwa 5,5 Millionen Menschen an ischämischen Schlaganfällen¹. Dieser Zustand ist durch die Unterbrechung des Blutflusses in eine bestimmte Hirnregion gekennzeichnet, was zu einem reversiblen oder irreversiblen Verlust in der Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen führt, was die Gewebefunktion verändert und zu mitochondrialer Dysfunktion, Kalziumdysregulation, Glutamatexzitotoxizität, Entzündung und Zellverlust^{führt 2,3}.

Neben Gefäßzellen sind neuronale und gliale Zellen an der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls^{beteiligt 4}. Insbesondere Sind Astrozyten für die Aufrechterhaltung von Neuronen von wesentlicher Bedeutung und haben in jüngster Zeit gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf die ischämische Läsion⁵spielen. Diese Art von Gliazelle erfüllt Funktionen der strukturellen Unterstützung, Abwehr gegen oxidativen Stress, Synthese von Neurotransmittern, Stabilisierung der Zell-Zell-Kommunikation, unter anderem⁶. Zusammen mit Neuronen spielen Astrozyten eine direkte Rolle bei der synaptischen Übertragung und regulieren die Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat, Gamma-Aminobuttersäure und Glutamat⁷. Ein Teil der durch Ischämie induzierten Verletzung wird durch die übermäßige Freisetzung von Glutamat und seine Akkumulation am synaptischen Spalt verursacht, was zur Überaktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren führt, die nachgeschaltete Signalkaskaden aktivieren, was letztlich zu Exzitotoxizität⁸führt. Da Astrozyten in der Lage sind, Glutamat aus dem synaptischen Spalten zu entfernen und in Glutamin umzuwandeln, sind sie entscheidend für die Abwehr von Exzitotoxizität und üben damit eine neuroprotektive Wirkung auf Ischämie aus. Diese Zellen spielen auch eine Rolle bei Derischämie-induzierten Neuroinflammation. Nach der ischämischen Beleidigung ereignen sich aktivierte Astrozyten morphologischen Veränderungen (Hypertrophie), vermehren sich und zeigen eine Zunahme der glialen fibrillären sauren Proteinexpression (GFAP). Sie können reaktiv werden (Astrogliose), pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und Interleukin-1″ freisetzen und freie Radikale, einschließlich Stickstoffmonoxid und Superoxid, produzieren, die wiederum den neuronalen^Tod9^,10induzieren können. Im Gegensatz dazu können reaktive Astrozyten auch eine neuroprotektive Wirkung spielen, da sie entzündungshemmende Zytokine freisetzen, wie z. B. die Transformation von Wachstumsfaktor-β, das nach Schlaganfall¹¹hochreguliert ist. Darüber hinaus können sie eine gliaale Narbe erzeugen, die die Geweberegeneration durch Hemmung des axonalen Keimens einschränken kann; diese Glianarbe kann jedoch die Verletzungsstelle von lebensfähigem Gewebe isolieren und so eine kaskadierende Welle unkontrollierter Gewebeschäden verhindern^12,13.

Daher ist es unerlässlich, Modelle zu etablieren, die die Untersuchung von neuron-glia Wechselwirkungen unter einer ischämischen Verletzung ermöglichen, um therapeutische Strategien zu finden, die die Auswirkungen ischämischer Verletzungen begrenzen oder umkehren. Im Vergleich zu anderen Modellen zur Erforschung ischämischer Verletzungen, nämlich in vivo-Modellen ^14,15,16, organotypische Kulturen^17,18,19 und akute Hirnscheiben^20,21,22, sind primäre Zellkulturen weniger komplex, was die Untersuchung einzelner Beiträge jedes Zelltyps in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ermöglicht und wie jeder Zelltyp auf mögliche therapeutische Ziele reagiert. Typischerweise werden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen neuronangereicherten Kulturen und astrozytenangereicherten Kulturen, Neuronen und Gliazellen postnatalen Ursprungs^23,,24oder postnatale Gliazellen und embryonale Neuronen^25,26verwendet. Hierin wird ein einfacher Ansatz vorgeschlagen, um neuron- oder astrozytenangereicherte Kulturen und Neuron-Glia-Kulturen aus demselben Gewebe zu etablieren. Diese Primärzellen werden aus dem embryonalen Kortex der Ratte gewonnen, einer Region, die häufig von Schlaganfall^27,28betroffen ist. Darüber hinaus wird die Dissoziation des Gewebes nur durch ein mechanisches Verfahren durchgeführt. Daher ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung von Zellen im gleichen Entwicklungsstadium, auf eine schnelle und kostengünstige Weise und mit hoher Leistung und Reproduzierbarkeit.

Das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen kann mit einem Kokultursystem erforscht werden, in dem neuronenkultivierte In-Coverlips kultivierte Neuronen in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multiwell-Platten gesät sind. Kleine Paraffinkugeln können verwendet werden, um die Trennung der beiden Zellkulturen zu gewährleisten. Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation jedes Zelltyps, bevor sie in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel ist es möglich, ein bestimmtes Gen in Astrozyten zum Schweigen zu bringen und zu sehen, wie es die neuronale Verletzlichkeit oder den Schutz vor ischämisch induzierten Schäden beeinflussen kann. Eine etablierte Methode zur Induzieren ischämisch-ähnlicher Bedingungen in vitro ist Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)³, die darin besteht, die normale Atmosphäre (95% Luft und 5%_CO2) durch eine anoxische Atmosphäre (95% N₂ und 5%_CO2) zu ersetzen, die mit dem Auslassung von Glukose verbunden ist.

Die beschriebene Methode eignet sich zur einfachen, schnellen, reproduzierbaren und kostengünstigen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten im Kontext eines ischämischen Schlaganfalls.