Un modèle de culture cellulaire pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans l’ischémie

Selon les données de l’Organisation mondiale de la santé, environ 5,5 millions de personnes meurent chaque année d’un AVC ischémique¹. Cette condition est caractérisée par l’interruption du flux sanguin vers une certaine région du cerveau, résultant en une perte réversible ou irréversible dans l’approvisionnement en oxygène et en nutriments du tissu, qui modifie la fonction tissulaire et conduit à un dysfonctionnement mitochondrial, dysrégulation du calcium, excitotoxicité glutamate, inflammation et perte cellulaire^2,3.

En dehors des cellules vasculaires, les cellules neuronales et gliales sont impliquées dans la pathophysiologie de l’AVC ischémique⁴. En particulier, les astrocytes sont essentiels à l’entretien des neurones et ont récemment été montrés pour jouer un rôle critique dans la réponse à la lésion ischémique⁵. Ce type de cellule gliale remplit les fonctions de soutien structurel, de défense contre le stress oxydatif, de synthèse des neurotransmetteurs, de stabilisation de la communication cellule-cellule, entre autres⁶. Avec les neurones, les astrocytes jouent un rôle direct dans la transmission synaptique, régulant la libération de molécules telles que l’adénosine triphosphate, l’acide gamma-aminobutyrique et le glutamate⁷. Une partie de la blessure induite par l’ischémie est causée par la libération excessive de glutamate et son accumulation à la fissure synaptique, conduisant à la suractivation des récepteurs N-méthyl-D-aspartate, l’activation en aval des cascades de signalisation, résultant finalement en excitotoxicité⁸. Puisque les astrocytes sont capables d’enlever le glutamate de la fente synaptique et de le convertir en glutamine, ils sont cruciaux dans la défense contre l’excitotoxicité, exerçant ainsi un effet neuroprotecteur sur l’ischémie. Ces cellules jouent également un rôle dans la neuroinflammation induite par l’ischémie. Après l’insulte ischémique, les astrocytes activés subissent des changements morphologiques (hypertrophie), prolifèrent, et montrent une augmentation de l’expression de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). Ils peuvent devenir réactifs (astrogliose), libérant des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale α, l’interleukine-1α et l’interleukine-1β, et produisant des radicaux libres, y compris l’oxyde nitrique et le superoxyde, qui à son tour peuvent induire la mort neuronale^9,10. En revanche, les astrocytes réactifs peuvent également jouer un effet neuroprotecteur, puisqu’ils libèrent des cytokines anti-inflammatoires, telles que la transformation du facteur de croissance β, qui est upregulated après l’AVC¹¹. En outre, ils peuvent générer une cicatrice gliale, qui peut limiter la régénération des tissus en inhibant la germination axonale; cependant, cette cicatrice gliale peut isoler le site de blessure du tissu viable, empêchant ainsi une vague en cascade de dommages incontrôlés de tissu^12,13.

Ainsi, il est impératif d’établir des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurone-glia sous une lésion ischémique afin de trouver des stratégies thérapeutiques qui limitent ou inversent les effets des lésions ischémiques. Par rapport à d’autres modèles utilisés pour étudier les lésions ischémiques, à savoir les modèles in vivo ^14,15,16, les cultures organotypices^17,18,19 et les tranches cérébrales aiguës^20,21,22, les cultures cellulaires primaires sont moins complexes, ce qui permet l’étude des contributions individuelles de chaque type de cellule dans la pathophysiologie de l’AVC ischémique et comment chaque type de cellule répond à des cibles thérapeutiques possibles. Typiquement, afin d’étudier les interactions entre les cultures enrichies de neurones et les cultures enrichies d’astrocytes, les neurones et les cellules gliales d’origine postnatale sont utilisés^23,24, ou cellules gliales gliales postnatales et neurones embryonnaires^25,26. Ici, on propose une approche simple pour établir des cultures et des cultures de neurones enrichies de neurones ou d’astrocytes et des cultures de neurones-glia à partir du même tissu. Ces cellules primaires sont obtenues à partir du cortex embryonnaire du rat, une région fréquemment affectée par l’AVC^27,28. En outre, la dissociation du tissu n’est effectuée que par une procédure mécanique. Par conséquent, ce protocole permet d’isoler les cellules dans le même stade de développement, d’une manière rapide et peu coûteuse, et avec des performances élevées et la reproductibilité.

Le croisement entre les astrocytes et les neurones peut être exploré à l’aide d’un système de co-culture dans lequel les neurones cultivés dans des couvercles sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes ensemencés dans des plaques multi-puits. De petites sphères de paraffine peuvent être utilisées pour assurer la séparation des deux cultures cellulaires. Cette approche permet une manipulation indépendante de chaque type de cellule avant qu’ils ne soient mis en contact. Par exemple, il est possible de réduire au silence un gène spécifique dans les astrocytes et de voir comment il peut influencer la vulnérabilité neuronale ou la protection contre les dommages induits par l’ischémique. Une méthode établie pour induire des conditions ischémiques in vitro est la privation d’oxygène et de glucose (OGD)³, qui consiste à remplacer l’atmosphère régulière (95% d’air et 5% de CO₂₎par une atmosphère anoxique (95% N₂ et 5% CO_2),associée à l’omission du glucose.

La méthode décrite convient à l’étude des interactions entre les neurones et les astrocytes dans le contexte d’un AVC ischémique, d’une manière simple, rapide, reproductible et peu coûteuse.