Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 5,5 milhões de pessoas morrem todos os anos por acidente vascular cerebral isquêmico¹. Essa condição é caracterizada pela interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região cerebral, resultando em uma perda reversível ou irreversível no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o tecido, o que altera a função tecidual e leva à disfunção mitocondrial, desregulação de cálcio, excitoxicidade do glutamato, inflamação e perda celular^2,,3.

Além das células vasculares, as células neuronais e gliais estão envolvidas na fisiopatologia do derrame isquêmico⁴. Em particular, os astrócitos são essenciais para a manutenção dos neurônios e recentemente mostraram-se um papel crítico na resposta à lesão isquêmica⁵. Este tipo de célula gliaial exerce funções de suporte estrutural, defesa contra estresse oxidativo, síntese de neurotransmissores, estabilização da comunicação célula-célula, entre outras⁶. Junto com os neurônios, os astrócitos desempenham um papel direto na transmissão sináptica, regulando a liberação de moléculas como triphosfato de adenosina, ácido gama-aminobutírico e glutamato⁷. Parte da lesão induzida pela isquemia é causada pela liberação excessiva de glutamato e seu acúmulo na fissura sináptica, levando à superativação de receptores N-metil-D-aspartato, ativando cascatas de sinalização a jusante, resultando em excitotoxicidade⁸. Uma vez que os astrócitos são capazes de remover o glutamato da fissura sináptica e convertê-lo em glutamina, eles são cruciais na defesa contra a excitotoxicidade, exercendo assim um efeito neuroprotetor sobre a isquemia. Essas células também desempenham um papel na neuroinflamação induzida pela isquemia. Após o insulto isquêmico, os astrócitos ativados sofrem alterações morfológicas (hipertrofia), proliferam e mostram um aumento na expressão de proteína ácida fibrilar gliana (GFAP). Eles podem se tornar reativos (astrogliose), liberando citocinas pró-inflamatórias como o fator necrose tumoral-α, interleucina-1α e interleucina-1β, e produzindo radicais livres, incluindo óxido nítrico e superóxido, que por sua vez pode induzir a morte neuronal^9,,10. Em contraste, os astrócitos reativas também podem ter um efeito neuroprotetor, uma vez que liberam citocinas anti-inflamatórias, como transformar fator de crescimento-β, que é regulado após o derrame¹¹. Além disso, podem gerar uma cicatriz glianal, que pode limitar a regeneração tecidual inibindo o broto axonal; no entanto, essa cicatriz gliaria pode isolar o local da lesão do tecido viável, evitando assim uma onda cascata de danos teciduais descontrolados^12,13.

Assim, é imprescindível estabelecer modelos que permitam estudar interações neurônio-glia sob uma lesão isquêmica, a fim de encontrar estratégias terapêuticas que limitem ou revertam os efeitos da lesão isquêmica. Comparado com outros modelos usados para estudar lesões isquêmicas, ou seja, os modelos in vivo ^14,,15,16, culturas organotípicas^17,,18,,19 e fatias cerebrais agudas^20,,21,,22, culturas celulares primárias são menos complexas, o que possibilita o estudo de contribuições individuais de cada tipo celular na fisiopatologia do derrame isquêmico e como cada tipo de célula responde a possíveis alvos terapêuticos. Tipicamente, para estudar as interações entre culturas enriquecidas por neurônios e culturas enriquecidas por astrócitos, são utilizados neurônios e células gliais de origem pós-natal^23,,24ou células gliais pós-natais e neurônios embrionários^25,,26. Aqui é proposto uma abordagem simples para estabelecer culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos e culturas neurônio-glia a partir do mesmo tecido. Essas células primárias são obtidas a partir do córtex embrionário de rato, uma região frequentemente afetada pelo acidente vascular cerebral^27,28. Além disso, a dissociação do tecido é realizada apenas por um procedimento mecânico. Portanto, este protocolo permite isolar células no mesmo estágio de desenvolvimento, de forma rápida e barata, e com alto desempenho e reprodutibilidade.

O crosstalk entre astrócitos e neurônios pode ser explorado usando um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos semeados em placas multiwell. Pequenas esferas de parafina podem ser usadas para garantir a separação das duas culturas celulares. Esta abordagem permite manipulação independente de cada tipo de célula antes de serem colocados em contato. Por exemplo, é possível silenciar um gene específico em astrócitos e ver como ele pode influenciar a vulnerabilidade neuronal ou proteção contra danos induzidos por isquêmicos. Um método estabelecido para induzir condições isquêmicas in vitro é a privação de oxigênio e glicose (OGD)³, que consiste em substituir a atmosfera regular (95% de ar e 5% DE CO₂) por uma atmosfera anoxica (95% N₂ e 5% CO_2),associada à omissão de glicose.

O método descrito é adequado para estudar as interações entre neurônios e astrócitos no contexto do AVC isquêmico, de forma simples, rápida, reprodutível e barata.