نموذج ثقافة الخلية لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في الإقفاري
Summary
هنا، نقدم نهجا بسيطا باستخدام وسائل الإعلام الثقافة المحددة التي تسمح بإنشاء الثقافات المخصبة الخلايا العصبية و الفلكية، أو الثقافات العصبية غليا من القشرة الجنينية، مع ارتفاع العائد والتكرار.
Abstract
السكتة الدماغية هي حالة سريرية تتميز بنقص في الدم في أنسجة الدماغ ، مما يؤدي إلى الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، وما يترتب على ذلك من فقدان الخلايا العصبية. تشير العديد من الأدلة إلى أن التفاعل بين الخلايا الدبقية والخلايا العصبية يمارس تأثيرات مفيدة بعد حدث نقص تروية. لذلك، لاستكشاف آليات الحماية المحتملة، من المهم تطوير نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا في بيئة نقص تروية. هنا نقدم نهجا بسيطا لعزل الخلايا الفلكية والخلايا العصبية من قشرة الجنين الفئران، وذلك باستخدام وسائل الإعلام ثقافة محددة، ويسمح بإنشاء الثقافات العصبية أو استروينست أو الثقافات العصبية glia مع قابلية إنتاج عالية.
لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، نقترح نهجا يستند إلى نظام الثقافة المشتركة التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في الأغطية في اتصال مع أحادية من الخلايا الفلكية مطلية في لوحات متعددة. يتم الحفاظ على الثقافتين بعيدا عن طريق مجالات البارافين الصغيرة. هذا النهج يسمح للتلاعب مستقلة وتطبيق علاجات محددة لكل نوع الخلية، والذي يمثل ميزة في العديد من الدراسات.
لمحاكاة ما يحدث أثناء السكتة الدماغية، وتخضع الثقافات إلى الأكسجين والجلوكوز بروتوكول الحرمان. يمثل هذا البروتوكول أداة مفيدة لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في السكتة الدماغية.
Introduction
وفقا لبيانات من منظمة الصحة العالمية، يموت حوالي 5.5 مليون شخص كل عام بسبب السكتة الدماغية الإقفارية1. يتميز هذا الشرط بانقطاع تدفق الدم إلى منطقة معينة من الدماغ ، مما يؤدي إلى فقدان عكسه أو لا رجعة فيه في إمدادات الأكسجين والمواد المغذية للأنسجة ، مما يغير وظيفة الأنسجة ويؤدي إلى خلل الميتوكوندريا ، dysregulation الكالسيوم ، استثارة الجلوتامات ، الالتهاب وفقدان الخلايا2،3.
وبصرف النظر عن الخلايا الوعائية، وتشارك الخلايا العصبية والزبقية في الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغيةالإقفارية 4. على وجه الخصوص، الخلايا الفلكية ضرورية للحفاظ على الخلايا العصبية، ومؤخرا تبين أن تلعب دورا حاسما في الاستجابة للآفات الإقفاري5. هذا النوع من الخلايا الدبقية يؤدي وظائف الدعم الهيكلي، والدفاع ضد الأكسدة، وتركيب الناقلات العصبية، واستقرار الاتصالات الخلوية، من بين أمور أخرى6. جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية، تلعب الخلايا الفلكية دورا مباشرا في انتقال متشابك، وتنظيم إطلاق جزيئات مثل الأدينوسين ثلاثي الفوسفات، حمض غاما أمينوبوتيريك والغلوتامات7. جزء من الإصابة الناجمة عن نقص التروية سببه الافراط في إطلاق الغلوتامات وتراكمه عند الشق المشبكى ، مما يؤدي إلى فرط تنشيط مستقبلات N-methyl-D-aspartate ، وتفعيل الشلالات الإشارات المصب ، مما أدى في نهاية المطاف إلى استثارة8. منذ الخلايا الفلكية قادرة على إزالة الغلوتامات من الشق متشابك وتحويلها إلى الجلوتامين، فهي حاسمة في الدفاع ضد السمية، وبالتالي ممارسة تأثير العصبية على نقص تروية. هذه الخلايا تلعب أيضا دورا في نقص التروية الناجمة عن العصبية. بعد الإهانة الإقفاريّة، تخضع الخلايا الفلكية المنشطة لتغييرات مورفولوجية (تضخم)، وتتكاثر، وتظهر زيادة في تعبير البروتين الهرفي الهرفي الحمضي (GFAP). يمكن أن تصبح رد الفعل (astrogliosis), إطلاق السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل الورم نخر عامل α, interleukin-1α وinterleukin-1β, وإنتاج الجذور الحرة, بما في ذلك أكسيد النيتريك و superoxide, والتي بدورها يمكن أن تحفز الموت العصبي9,10. في المقابل، قد تلعب الخلايا الفلكية التفاعلية أيضًا تأثيرًا عصبيًا، نظرًا لأنها تطلق السيتوكينات المضادة للالتهابات، مثل تحويل عامل النمو β، الذي يتم تنظيمه بعد السكتة الدماغية11. وعلاوة على ذلك, أنها يمكن أن تولد ندبة الدبقية, التي يمكن أن تحد من تجديد الأنسجة عن طريق تثبيط تنبت محور عصبي; ومع ذلك، يمكن لهذه الندبة الدبقية عزل موقع الإصابة من الأنسجة القابلة للحياة، وبالتالي منع موجة متتالية من تلف الأنسجة غير المنضبط12،13.
وبالتالي، لا بد من إنشاء نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا تحت إصابة إقفاري من أجل العثور على استراتيجيات علاجية تحد أو تعكس آثار الإصابة الإقفاري. مقارنة مع النماذج الأخرى المستخدمة لدراسة إصابة الإقفار، وهي في نماذج vivo 14,15,16, الثقافات العضوية17,18,19 و شرائح الدماغ الحادة20,21,22, الثقافات الأولية الخلية هي أقل تعقيدا, مما يجعل من الممكن دراسة المساهمات الفردية لكل نوع خلية في الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية وكيف يستجيب كل نوع خلية للأهداف العلاجية المحتملة. عادة، من أجل دراسة التفاعلات بين الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية والثقافات المخصبة الفلكية، وتستخدم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من أصل ما بعد الولادة23،24، أو الخلايا الدبقية بعد الولادة والخلايا العصبية الجنينية25،26. ويقترح هنا نهجا بسيطا لإنشاء العصبية أو الثقافات المخصب استروينية الخلايا العصبية والخلايا العصبية- غليا الثقافات من نفس الأنسجة. يتم الحصول على هذه الخلايا الأولية من قشرة الجنين الفئران، وهي منطقة تتأثر كثيرا من السكتة الدماغية27،28. وعلاوة على ذلك ، يتم فصل الأنسجة فقط عن طريق إجراء ميكانيكي. لذلك ، يسمح هذا البروتوكول عزل الخلايا في نفس مرحلة التطوير ، بطريقة سريعة وغير مكلفة ، ومع الأداء العالي وقابلية التكاثر.
يمكن استكشاف الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام نظام الثقافة المشتركة التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في الأغطية على اتصال مع أحادية الطبقة من الخلايا الفلكية مبذرة في لوحات متعددة. ويمكن استخدام مجالات البارافين الصغيرة لضمان الفصل بين ثقافتي الخلية. يسمح هذا النهج بمعالجة مستقلة لكل نوع خلية قبل أن يتم الاتصال بها. على سبيل المثال، من الممكن إسكات جين معين في الخلايا الفلكية ونرى كيف يمكن أن تؤثر على ضعف الخلايا العصبية أو الحماية ضد الضرر الناجم عن الإقفار. وهناك طريقة راسخة للحث على حالات تشبه الإقفارية في المختبر هو الأكسجين والحرمان من الجلوكوز (OGD)3، والذي يتكون في استبدال الغلاف الجوي العادي (95٪ الهواء و 5 ٪ CO2)عن طريق الغلاف الجوي anoxic (95 ٪ N2 و 5 ٪ CO2) ، المرتبطة إغفال الجلوكوز.
الطريقة الموصوفة مناسبة لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الفلكية في سياق السكتة الدماغية الإقفارية ، بطريقة بسيطة وسريعة وقابلة للتكرار وغير مكلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا تتكون من العزلة الفلكية والخلايا العصبية من الأنسجة القشرية الجنينية الفئران، مما يسمح بإنشاء الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية أو الخلايا الفلكية أو الثقافات العصبية غليا. وقد تم تكييفها من دراسة سابقة لمجموعتنا5, حيث وصفت الخلايا العصبية القشرية – glia …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي الذي قدمته Fundação para a Ciência e a Tecnologia من خلال المشاريع UIDB/00709/2020 و POCI-01-0145-FEDER-029311 والزمالة SFRH/BD/135936/2018 إلى JP، بواسطة ”Programa Operacional do Centro، Centro 2020″ من خلال مشروع CENTRO-01-0145-FEDER-000013 والتمويل إلى منصة PPBI البرتغالية ل BioImaging من خلال مشروع POCI-01-0145-FEDER-022122.
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
References
- Donkor, E. S. Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).
- Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
- Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology. International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).
- Roque, C., Baltazar, G. Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).
- Ransom, B. R., Ransom, C. B. Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system. Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).
- Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).
- Forder, J. P., Tymianski, M. Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules. Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).
- Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome. Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).
- Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Huang, L., et al. Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke. International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).
- Rodriguez-Grande, B., et al. The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).
- Cheng, X., et al. Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers. Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).
- Wang, X., et al. Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).
- Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).
- Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).
- Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures. Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).
- Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
- Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
- Tamura, R., et al. Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).
- Dennis, S. H., et al. Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors. Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).
- Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine. PLoS One. 13 (10), (2018).
- Kuszczyk, M. A., et al. Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration. American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).
- Skaper, S. D., Facci, L. Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents. Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).
- Fang, A., et al. Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure. BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).
- Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke. Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).
- Zhao, L. R., Willing, A. Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research. Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).
- Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex. Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).
- Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).
- Almeida, A., Medina, J. M. A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture. Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).
- Bessa, A., et al. GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons. Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).
- De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds. International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).
- Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. An in vitro model of ischemic stroke. Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).
- Holloway, P. M., Gavins, F. N. Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives. Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).
- Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia. Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).
