הערכת PCR בזמן אמת כמותית של ביטויי microRNA בכליות עכבר עם חסימה חד צדדית שופך
Summary
אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי microRNA בכליות של עכברים עם חסימה חד צדדית שופכה (UUO) על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי. פרוטוקול זה מתאים לחקר פרופילי ביטוי microRNA של כליה בעכברים עם UUO ובהקשר של תנאים פתולוגיים אחרים.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) הם מולקולות RNA נטושות בודדות, שאינן מקודדות, שבדרך כלל מווסתות את ביטוי הגנים ברמה שלאחר שעתוק על-ידי כריכה לאתרי יעד משלימים חלקית באזור 3′ לא מתורגם (UTR) של מסנג’ר RNA (mRNA), מה שמפחית את התרגום והיציבות של ה-mRNA. פרופילי ביטוי miRNA באיברים שונים ורקמות של עכברים נחקרו, אבל שיטות סטנדרטיות לטיהור וכמת של miRNA בכליות העכבר לא היו זמינים. הקמנו שיטה יעילה ואמינה לחילוץ והערכה של ביטוי miRNA בכליות העכבר עם פיברוזיס בין-זמני של הכליה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (qRT-PCR). הפרוטוקול דרש חמישה שלבים: (1) יצירת עכברים מזויפים וחד-צדדיים של חסימה שופך (UUO). (2) חילוץ דגימות כליות מעכברי UUO; (3) חילוץ של RNA הכולל, הכולל miRNA, מדגימות הכליה; (4) סינתזה משלימה DNA (cDNA) עם שעתוק הפוך מmiRNA; ותונומתה (5) qRT-PCR באמצעות ה- cDNA. באמצעות פרוטוקול זה, אישרנו בהצלחה כי בהשוואה לפקדים, הביטוי של miRNA-3070-3p גדל באופן משמעותי ואלה של miRNA-7218-5p ו miRNA-7219-5p ירדו באופן משמעותי בכליות של מודל העכבר של פיברוזיס בין-גזעי הכליה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את ביטוי miRNA בכליות של עכברים עם UUO.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) — RNAs קצר, noncoding שגורמים להשפלה ועיכוב שעתוק של RNA שליח (mRNA)1 — הוצגו לווסת את הביטוי של mRNAs שונים שיש להם תפקידים מכריעים הן פיזיולוגיה ומחלה (למשל, דלקת, פיברוזיס, הפרעות מטבוליות, וסרטן). חלק miRNAs ולכן עשוי להיות מועמד רומן סמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליותעבור מגוון רחב של מחלות 2,,3,,4,,5. למרות פרופילי ביטוי miRNA באיברי עכבר ורקמות כולל המוח, הלב, הריאה, הכבד, וכליהתוארו 6,7,88,9,10, לא היו שיטות סטנדרטיות לחילוץ והערכה של miRNAs בכליות עכבר עם פיברוזיס בין-כליתי.
עיצבנו פרוטוקול כדי לטהר ולזהות באופן אמין את הביטויים של miRNAs בכליות של עכברים עם פיברוזיס interstitial כליות. הפרוטוקול כולל חמישה שלבים עיקריים, כדלקמן. (1) עכברים זכרים בני 8 שבועות מחולקים לקבוצות של עכברים העוברים ניתוח מזויף (פקדים) ועכברים הנתונים לניתוח המספק חסימה חד-צדדית של שופכות (UUO), המקושר לפיברוזיס בין-גזעי של כליות. (2) דגימות כליות מופקות מעכברי זיוף וUO, homogenized בנפרד הומוגנייזר סיליקון, ולאחר מכן מועברים למערכת גריסה biopolymer על עמודה ספין microcentrifuge11,12. (3) RNA הכולל המכיל miRNA מופק מדגימות הכליה על ידי עמודת ספין מבוססת קרוםסיליקה 12,13. (4) באמצעות RNA הכולל שחולץ זה, DNA משלים (cDNA) מסונתז מן RNA הכולל עם השימוש תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימר oligo-dT14,,15. (5) הביטויים של miRNAs מוערכים על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (qRT-PCR) באמצעות צבע intercalating14,15.
פרוטוקול זה מבוסס על חקירות שהשיגו עקירות משמעותיות והערכות של miRNAsבמגוון רקמות 11,12,13,14,15, ואת מערכת גריסה biopolymer בשימוש בפרוטוקול הוצג לטהר באיכות גבוהה, סך RNA מרקמות ב 200612., בנוסף, מחקרים קודמים אישרו את הדיוק והרגישות של היבטים של הפרוטוקול (כלומר, סינתזה cDNA עם תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימרים oligo-dT מ RNA הכולל שחולצו) לקביעת ביטוי miRNA על ידי qRT-PCR עםצבע intercalating 14,15. מאז הפרוטוקול החדש יש את היתרונות של פשטות, חיסכון בזמן, והפחתת שגיאות טכניות, הפרוטוקול יכול לשמש במחקר הדורש זיהוי מדויק ורגיש של פרופיל miRNA בכליות העכבר. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על חקירות של תנאים פתולוגיים רבים.
אנו מתארים בשלב הבא את הקביעה של פרופילי ביטוי miRNA בעכברים עם UUO, אשר מקושר פיברוזיס interstitial כליות. אצל בני אדם, פיברוזיס interstitial כליות היא תכונה נפוצה וחשובה של מחלת כליות כרונית ומחלת כליות סוף שלב, ללא קשר אטיולוגיהשלהם 16,17. פיברוזיס זה של כליות קשור להתקדמות אי ספיקת כליות, והוא מאופיין בביטויים מוגברים של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים בחללים הבין-מערכתיים (לדוגמה, קולגן, פיברונטין ו-α-smooth muscle actin)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול שתואר לעיל עם qRT-PCR קבע בהצלחה את רמות הביטוי של miRNAs המיועדים. ההערכה של miRNAs שחולצו חשובה כאשר מבקשים להשיג נתוני qRT-PCR משמעותיים, ועל מנת לאשר את איכות miRNAs לפני ביצוע qRT-PCR, היחס של ספיגה ב 260 טנומטר כי ב 280 טנ”מ צריך להיבדק עם ספקטרופוטומטר. אם לא ניתן להשיג התעצמות PCR אחת של האורך הצפו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למישל גודי, PhD, מ-Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
