Quantitative Echtzeit-PCR-Bewertung von microRNA-Expressions in der Mausniere mit einseitiger ureteraler Obstruktion
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion (UUO) durch quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Dieses Protokoll eignet sich zur Untersuchung von Nieren-MicroRNA-Expressionsprofilen bei Mäusen mit UUO und im Kontext anderer pathologischer Erkrankungen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind einsträngige, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die typischerweise die Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene regulieren, indem sie an teilweise komplementäre Zielstandorte in der 3′ unübersetzten Region (UTR) von Messenger RNA (mRNA) binden, was die Translation und Stabilität der mRNA reduziert. Die miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen Organen und Geweben von Mäusen wurden untersucht, standardmethoden zur Reinigung und Quantifizierung von miRNA in der Mausniere waren jedoch nicht verfügbar. Wir haben eine effektive und zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung der miRNA-Expression in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose durch quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) etabliert. Das Protokoll erforderte fünf Schritte: (1) Schaffung von Schein- und einseitigen Harnleiter-Obstruktions-Mäusen (UUO); (2) Extraktion von Nierenproben von den UUO-Mäusen; (3) Extraktion der gesamten RNA, einschließlich miRNA, aus den Nierenproben; (4) komplementäre DNA-Synthese (cDNA) mit umgekehrter Transkription aus miRNA; und (5) qRT-PCR mit dem cDNA. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich bestätigt, dass im Vergleich zu den Kontrollen die Expression von miRNA-3070-3p signifikant erhöht wurde und die von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p signifikant in den Nieren eines Mausmodells der renalen interstitiellen Fibrose verringert wurden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die miRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit UUO zu bestimmen.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) – die kurzen, nicht kodierenden RNAs, die den Abbau und die transkriptionelle Hemmung von Boten-RNA (mRNA)1 verursachen – regulieren nachweislich die Expression verschiedener mRNAs, die sowohl in der Physiologie als auch bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielen (z. B. Entzündungen, Fibrose, Stoffwechselstörungen und Krebs). Einige der miRNAs können daher Kandidaten neuartige Biomarker und therapeutische Ziele für eine Vielzahl von Krankheiten2,3,4,5. Obwohl miRNA-Expressionsprofile in Mausorganen und Geweben einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Leber und Niere beschrieben wurden6,7,8,9,10, gab es keine Standardmethoden für die Extraktion und Bewertung von miRNAs in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose.
Wir haben ein Protokoll entwickelt, um die Ausdrücke von miRNAs in den Nieren von Mäusen mit renaler interstitielle Fibrose zuverlässig zu reinigen und zu detektieren. Das Protokoll umfasst fünf Hauptschritte, wie folgt. (1) 8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden in Gruppen von Mäusen eingeteilt, die einer Scheinoperation (Kontrollen) unterzogen werden, und Mäusen, die einer Operation unterzogen werden, die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) bietet, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. (2) Nierenproben werden aus den Schein- und UUO-Mäusen extrahiert, in einem Siliziumhomogenisator getrennt homogenisiert und dann auf eine Mikrozentrifugen-Spin-Säule11,12in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem übertragen. (3) Die gesamte RNA, die miRNA enthält, wird aus den Nierenproben durch eine Kieselsäuremembran-basierte Spinsäule12,13extrahiert. (4) Mit Dieser extrahierten Gesamt-RNA wird komplementäre DNA (cDNA) aus der gesamten RNA unter Verwendung von Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer14,15synthetisiert. (5) Die Ausdrücke von miRNAs werden durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) mit einem interkalierenden Farbstoff14,15ausgewertet.
Dieses Protokoll basiert auf Untersuchungen, die sinnvolle Extraktionen und Auswertungen von miRNAs in einer Vielzahl von Geweben erhaltenhaben 11,12,13,14,15, und das im Protokoll verwendete Biopolymer-Zerkleinerungssystem wurde 2006 nachweislich hochwertige, gesamte RNA aus Geweben gereinigt12. Darüber hinaus haben frühere Studien die Genauigkeit und Empfindlichkeit von Aspekten des Protokolls (d. h. der cDNA-Synthese mit Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern aus extrahierter Gesamt-RNA) zur Bestimmung der miRNA-Expression durch qRT-PCR mit einem interkalierenden Farbstoff14,15bestätigt. Da das neue Protokoll die Vorteile der Einfachheit, Zeitersparnis und Reduzierung von technischen Fehlern hat, kann das Protokoll in der Forschung verwendet werden, die eine genaue und sensible Identifizierung des miRNA-Profils in der Mausniere erfordert. Darüber hinaus könnte das Protokoll auf Untersuchungen unter vielen pathologischen Bedingungen angewendet werden.
Als nächstes beschreiben wir die Bestimmung der miRNA-Expressionsprofile bei Mäusen mit UUO, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. Beim Menschen, renale interstitielle Fibrose ist ein häufiges und wichtiges Merkmal sowohl der chronischen Nierenerkrankung und im Endstadium Nierenerkrankungen, unabhängig von ihrer Ätiologie16,17. Diese renale interstitielle Fibrose ist mit dem Fortschreiten des Nierenversagens verbunden und zeichnet sich durch erhöhte Ausdrücke extrazellulärer Matrixkomponenten in den interstitiellen Räumen (z.B. Kollagen, Fibronectin und α-glatten Muskelakt)17,18aus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Protokoll mit qRT-PCR hat erfolgreich die Expressionsebenen der zielgerichteten miRNAs bestimmt. Die Bewertung der extrahierten miRNAs ist wichtig, wenn man sinnvolle qRT-PCR-Daten erhalten möchte, und um die Qualität der miRNAs vor der Durchführung der qRT-PCR zu bestätigen, sollte das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu dem bei 280 nm mit einem Spektralphotometer überprüft werden. Wenn eine einzelne PCR-Verstärkung der erwarteten Länge und Schmelztemperatur oder eine monomodale Schmel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Michelle Goody, PhD, von der Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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