Évaluation quantitative en temps réel du PCR des expressions microARN dans le rein de souris avec obstruction urérale unilatérale
Summary
Nous décrivons une méthode pour évaluer l’expression de microARN dans les reins des souris avec l’obstruction ureterale unilatérale (UUO) par la réaction quantitative de la chaîne de transcription inverse-polymérase. Ce protocole convient pour étudier les profils d’expression de microARN de rein chez les souris avec UUO et dans le contexte d’autres conditions pathologiques.
Abstract
Les microARN (miARN) sont des molécules d’ARN uniques et non codantes qui régulent généralement l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel en se liant à des sites cibles partiellement complémentaires dans la région non traduite (UTR) de l’ARN messager (ARNm) 3′, ce qui réduit la traduction et la stabilité de l’ARNm. Les profils d’expression miRNA dans divers organes et tissus de souris ont été étudiés, mais les méthodes standard pour la purification et la quantification du miRNA dans le rein de souris n’ont pas été disponibles. Nous avons établi une méthode efficace et fiable pour extraire et évaluer l’expression de miRNA dans le rein de souris avec la fibrose interstitielle rénale par la réaction quantitative de la polymérase de transcription inverse (qRT-PCR). Le protocole exigeait cinq étapes : (1) la création de souris d’obstruction uterérale et unilatérales ( UUO); (2) l’extraction d’échantillons de rein sur les souris UUO; (3) l’extraction de l’ARN total, qui comprend le miARN, à partir des échantillons de rein; (4) synthèse complémentaire de l’ADN (ADC) avec transcription inversée du miARN; et (5) qRT-PCR à l’aide de l’ADD. En utilisant ce protocole, nous avons confirmé avec succès que par rapport aux contrôles, l’expression de miRNA-3070-3p a été significativement augmentée et ceux de miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p ont été significativement diminués dans les reins d’un modèle de souris de la fibrose interstitielle rénale. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’expression miRNA dans les reins des souris avec UUO.
Introduction
Il a été démontré que les microARN (miARN) — les ARN courts et non coodants qui causent la dégradation et l’inhibition transcriptionnelle de l’ARN messager (ARNm)1 — régulent l’expression de divers ARNm qui jouent un rôle crucial dans la physiologie et la maladie (p. ex., inflammation, fibrose, troubles métaboliques et cancer). Certains des miARN peuvent donc être candidats de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques pour une variété de maladies2,3,4,5. Bien que les profils d’expression miRNA dans les organes et les tissus de souris, y compris le cerveau, le cœur, le poumon, le foie, et les reins ont été décrits6,7,8,9,10, il n’y a eu aucune méthode standard pour l’extraction et l’évaluation des miARN dans le rein de souris avec la fibrose interstitielle rénale.
Nous avons conçu un protocole pour purifier et détecter de manière fiable les expressions des miARN dans les reins des souris atteintes de fibrose interstitielle rénale. Le protocole comporte cinq étapes principales, comme suit. (1) Les souris mâles C57BL/6 de 8 semaines sont divisées en groupes de souris qui subissent une opération simulée (contrôles) et de souris qui sont soumises à une chirurgie fournissant l’obstruction uréterale unilatérale (UUO), qui est liée à la fibrose interstitielle rénale. (2) Les échantillons de rein sont extraits de la fausse et des souris UUO, homogénéisés séparément dans un homogénéisant de silicium, puis transférés à un système de biopolymère-déchiquetage sur une colonne de spin microcentrifuge11,12. (3) L’ARN total contenant du miARN est extrait des échantillons de rein par une colonne de spin à base de membrane de silice12,13. (4) À l’aide de cet ARN total extrait, l’ADN complémentaire (ADNC) est synthétisé à partir de l’ARN total avec l’utilisation de la transcriptase inverse, de la polymérase(A) et de l’amorce oligo-dT14,15. (5) Les expressions des miARN sont évaluées par réaction quantitative en chaîne de polymérase à transcription inverse (qRT-PCR) à l’aide d’un colorant intercalé14,15.
Ce protocole est basé sur des enquêtes qui ont obtenu des extractions significatives et des évaluations de miARN dans une variété de tissus11,12,13,14,15, et le système de biopolymère-déchiquetage utilisé dans le protocole a été montré pour purifier de haute qualité, ARN total des tissus en 200612. En outre, des études antérieures ont confirmé l’exactitude et la sensibilité des aspects du protocole (c.-à-d. la synthèse de l’ADC avec la transcriptase inverse, la polymérase polymérase, et les amorces oligo-dT de l’ARN total extrait) pour la détermination de l’expression miRNA par qRT-PCR avec un colorant intercalant14,15. Puisque le nouveau protocole a les avantages de la simplicité, de l’économie de temps, et la réduction des erreurs techniques, le protocole peut être utilisé dans la recherche qui nécessite l’identification précise et sensible du profil miRNA dans le rein de souris. En outre, le protocole pourrait être appliqué aux investigations de beaucoup de conditions pathologiques.
Nous décrivons ensuite la détermination des profils d’expression de miRNA chez les souris avec UUO, qui est lié à la fibrose interstitielle rénale. Chez l’homme, la fibrose interstitielle rénale est une caractéristique commune et importante de la maladie rénale chronique et de la maladie rénale terminale, indépendamment de leur étiologie16,17. Cette fibrose interstitielle rénale est associée à la progression de l’insuffisance rénale, et elle se caractérise par une augmentation des expressions des composants de matrice extracellulaire dans les espaces interstitiels (p. ex., collagène, fibronectine et actine musculaire lisse α)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ci-dessus avec qRT-PCR a réussi à déterminer les niveaux d’expression des miARN ciblés. L’évaluation des miARN extraits est importante lorsqu’on cherche à obtenir des données qRT-PCR significatives, et afin de confirmer la qualité des miARN avant d’effectuer le qRT-PCR, le rapport d’absorption à 260 nm à celui de 280 nm doit être vérifié avec un spectrophotomètre. Si une seule amplification pcr de la longueur prévue et de la température de fusion ou une courbe de fusion mono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Michelle Goody, Ph.D., du Groupe Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) d’avoir édité une ébauche de ce manuscrit.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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