Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale
Summary
Descriviamo un metodo per valutare l’espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono singole molecole di RNA non codificanti che in genere regolano l’espressione genica a livello post-trascrizionale legandole a siti bersaglio parzialmente complementari nella regione non tradotta (UTR) dell’RNA messaggero (mRNA), che riduce la traduzione e la stabilità dell’mRNA. I profili di espressione miRNA in vari organi e tessuti dei topi sono stati studiati, ma i metodi standard per la purificazione e la quantificazione del miRNA nel rene del topo non sono stati disponibili. Abbiamo stabilito un metodo efficace e affidabile per estrarre e valutare l’espressione del miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Il protocollo richiedeva cinque fasi: (1) creazione di topi finti e unilaterali di ostruzione ureterale (UUO); (2) estrazione di campioni renali dai topi UUO; (3) estrazione dell’RNA totale, che include il miRNA, dai campioni di rene; (4) sintesi del DNA complementare (cDNA) con trascrizione inversa dal miRNA; e (5) qRT-PCR utilizzando il cDNA. Utilizzando questo protocollo, abbiamo confermato con successo che rispetto ai controlli, l’espressione di miRNA-3070-3p è stata significativamente aumentata e quelli di miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p sono stati significativamente diminuiti nei reni di un modello murino di fibrosi interstiziale renale. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare l’espressione di miRNA nei reni dei topi con UUO.
Introduction
I microRNA (miRNA) – gli RNA corti e non codificanti che causano la degradazione e l’inibizione trascrizionale dell’RNA messaggero (mRNA)1 – hanno dimostrato di regolare l’espressione di vari mRNA che hanno ruoli cruciali sia nella fisiologia che nella malattia (ad esempio, infiammazione, fibrosi, disturbi metabolici e cancro). Alcuni dei miRNA possono quindi essere candidati nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici per una varietà di malattie2,3,4,5. Anche se i profili di espressione del miRNA negli organi murini e nei tessuti, tra cui cervello, cuore, polmone, fegato e rene sono statidescritti 6,7,8,9,10, non ci sono stati metodi standard per l’estrazione e la valutazione dei miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale.
Abbiamo progettato un protocollo per purificare e rilevare in modo affidabile le espressioni dei miRNA nei reni dei topi con fibrosi interstiziale renale. Il protocollo prevede cinque passaggi principali, come indicato di seguito. (1) I topi maschi C57BL/6 di 8 settimane sono divisi in gruppi di topi che subiscono un’operazione fittizia (controlli) e topi sottoposti a un intervento chirurgico che fornisce ostruzione ureterale unilaterale (UUO), che è collegata alla fibrosi interstiziale renale. (2) I campioni di rene vengono estratti dai topi finti e UUO, omogeneizzati separatamente in un omogeneizzatore di silicio, e poi trasferiti in un sistema di triturazione del biopolimero su una colonna di spin microcentrifuge11,12. (3) L’RNA totale contenente miRNA viene estratto dai campioni renali da una colonna di spin a base di membrana di silice12,13. (4) Utilizzando questo RNA totale estratto, il DNA complementare (cDNA) viene sintetizzato dall’RNA totale con l’uso di trascrizione inversa, polimerasi poli(A) e oligo-dT primer14,15. (5) Le espressioni dei miRNA sono valutate mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) utilizzando un colorante intercalante14,15.
Questo protocollo si basa su indagini che hanno ottenuto estrazioni significative e valutazioni di miRNA in una varietà di tessuti11,12,13,14,15, e il sistema di triturazione del biopolimero utilizzato nel protocollo è stato indicato per purificare alta qualità, RNA totale dai tessuti nel 200612. Inoltre, studi precedenti hanno confermato l’accuratezza e la sensibilità di aspetti del protocollo (cioè la sintesi cDNA con trascrizione inversa, polimerasi poli(A) e primer oligo-dT dall’RNA totale estratto) per la determinazione dell’espressione del miRNA da qRT-PCR con un colorante intercalante14,15. Dal momento che il nuovo protocollo ha i vantaggi di semplicità, risparmio di tempo, e la riduzione degli errori tecnici, il protocollo può essere utilizzato nella ricerca che richiede l’identificazione accurata e sensibile del profilo miRNA nel rene del topo. Inoltre, il protocollo potrebbe essere applicato alle indagini su molte condizioni patologiche.
Descriviamo poi la determinazione dei profili di espressione miRNA nei topi con UUO, che è legata alla fibrosi interstiziale renale. Nell’uomo, la fibrosi interstiziale renale è una caratteristica comune e importante sia della malattia renale cronica che della malattia renale dello stadio finale, indipendentemente dalla loro eziologia16,17. Questa fibrosi interstiziale renale è associata alla progressione dell’insufficienza renale, ed è caratterizzata da una maggiore espressione di componenti di matrice extracellulare negli spazi interstiziali (ad esempio, collagene, fibronectina e actin muscolare α liscio)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sopra descritto con qRT-PCR ha determinato con successo i livelli di espressione dei miRNA mirati. La valutazione dei miRNA estratti è importante quando si cerca di ottenere dati qRT-PCR significativi e, al fine di confermare la qualità dei miRNA prima di eseguire il qRT-PCR, il rapporto di assorbimento a 260 nm a quello a 280 nm deve essere controllato con uno spettrofotometro. Se una singola amplificazione PCR della lunghezza prevista e della temperatura di fusione o una curva di fusione monomodale non …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Michelle Goody, PhD, di Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) per aver modificato una bozza di questo manoscritto.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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