Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral
Summary
Descrevemos um método para avaliar a expressão de microRNA nos rins de camundongos com obstrução ureteral unilateral (UUO) por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa. Este protocolo é adequado para estudar perfis de expressão de microRNA renal em camundongos com UUO e no contexto de outras condições patológicas.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificadas e não codificadas que normalmente regulam a expressão genética no nível pós-transcricional, vinculando-se a locais-alvo parcialmente complementares na região não traduzida (UTR) de RNA mensageiro (mRNA), o que reduz a tradução e estabilidade do mRNA. Os perfis de expressão miRNA em vários órgãos e tecidos de camundongos foram investigados, mas métodos padrão para a purificação e quantificação do miRNA no rim de camundongos não estão disponíveis. Estabelecemos um método eficaz e confiável para extrair e avaliar a expressão miRNA no rim do rato com fibrose intersticial renal por reação quantitativa de cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR). O protocolo exigia cinco etapas: (1) criação de camundongos de obstrução ureteral falsa e unilateral (UUO); (2) extração de amostras de rins dos camundongos UUO; (3) extração do RNA total, que inclui miRNA, a partir das amostras de rim; (4) síntese complementar de DNA (cDNA) com transcrição reversa do miRNA; e (5) qRT-PCR utilizando o cDNA. Usando este protocolo, confirmamos com sucesso que, em comparação com os controles, a expressão de miRNA-3070-3p foi significativamente aumentada e as de miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foram significativamente diminuídas nos rins de um modelo de camundongo de fibrose interstícia renal. Este protocolo pode ser usado para determinar a expressão miRNA nos rins de camundongos com UUO.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) — os RNAs curtos e não codificados que causam a degradação e inibição transcricional do RNA mensageiro (mRNA)1 — têm mostrado regular a expressão de vários mRNAs que têm papéis cruciais tanto na fisiologia quanto na doença (por exemplo, inflamação, fibrose, distúrbios metabólicos e câncer). Alguns dos miRNAs podem, portanto, ser novos biomarcadores candidatos e alvos terapêuticos para uma variedade de doenças2,3,,4,5. Embora os perfis de expressão do miRNA em órgãos e tecidos do camundongo, incluindo cérebro, coração, pulmão, fígado e rim tenham sido descritos6,7,8,9,10, não houve métodos padrão para a extração e avaliação de miRNAs em rim de camundongo com fibrose intersticial renal.
Nós projetamos um protocolo para purificar e detectar de forma confiável as expressões de miRNAs nos rins de camundongos com fibrose interstícia renal. O protocolo envolve cinco etapas principais, da seguinte forma. (1) Camundongos machos C57BL/6 de 8 semanas de idade são divididos em grupos de camundongos submetidos a uma operação falsa (controles) e camundongos submetidos a uma cirurgia que fornece obstrução ureteral unilateral (UUO), que está ligada à fibrose intersticial renal. (2) As amostras de rim são extraídas dos camundongos sham e UUO, homogeneizadas separadamente em um homogeneizador de silício e, em seguida, transferidas para um sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de spin de microcentrifuuge11,,12. (3) O RNA total contendo miRNA é extraído das amostras de rim por uma coluna de spin baseada em membrana sílica12,13. (4) Utilizando este RNA total extraído, o DNA complementar (cDNA) é sintetizado a partir do RNA total com o uso de transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primer oligo-dT14,15. (5) As expressões de miRNAs são avaliadas pela reação quantitativa da cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR) utilizando um corante intercalante14,15.
Este protocolo baseia-se em investigações que obtiveram extrações significativas e avaliações de miRNAs em uma variedade de tecidos11,,12,,13,,14,15, e o sistema de trituração de biopolímeros utilizado no protocolo foi mostrado para purificar RNA total de alta qualidade dos tecidos em 200612. Além disso, estudos anteriores confirmaram a exatidão e sensibilidade dos aspectos do protocolo (ou seja, a síntese de cDNA com transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo-dT do RNA total extraído) para a determinação da expressão miRNA por qRT-PCR com um corante intercalante14,15. Como o novo protocolo tem as vantagens da simplicidade, economia de tempo e redução de erros técnicos, o protocolo pode ser usado em pesquisas que exigem a identificação precisa e sensível do perfil miRNA no rim do rato. Além disso, o protocolo poderia ser aplicado a investigações de muitas condições patológicas.
Em seguida, descrevemos a determinação dos perfis de expressão miRNA em camundongos com UUO, que está ligado à fibrose intersticial renal. Em humanos, a fibrose intersticial renal é uma característica comum e importante tanto da doença renal crônica quanto da doença renal em estágio terminal, independentemente de sua etiologia16,17. Esta fibrose intersticial renal está associada à progressão da insuficiência renal, e é caracterizada pelo aumento das expressões de componentes da matriz extracelular nos espaços intersticiais (por exemplo, colágeno, fibronectina e actina muscular α suave)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descrito com qRT-PCR determinou com sucesso os níveis de expressão dos miRNAs direcionados. A avaliação das miRNAs extraídas é importante na busca de obter dados significativos de qRT-PCR, e a fim de confirmar a qualidade dos miRNAs antes de realizar o qRT-PCR, a razão de absorção em 260 nm para que em 280 nm deve ser verificada com um espectótmetro. Se uma única amplificação pcr do comprimento esperado e temperatura de fusão ou uma curva de fusão monomodal não pode ser obtida por qRT-PC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Michelle Goody, PhD, do Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar um rascunho deste manuscrito.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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