Количественная оценка ПЦР в реальном времени микроРНК выражений в мышеловой почки с односторонним мочеборным препятствием
Summary
Мы описываем метод оценки экспрессии микроРНК в почках мышей с односторонней мочеизъемной обструкцией (UUO) по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Этот протокол подходит для изучения профилей экспрессии микроРНК почек у мышей с UUO и в контексте других патологических состояний.
Abstract
МикроРНК (миРНК) являются одиночными мель, некодирующие молекулы РНК, которые обычно регулируют экспрессию генов на посттранскриптном уровне путем связывания с частично взаимодополняющими целевыми объектами в 3′ непереведенной области (UTR) РНК-мессенджера (мРНК), что снижает перевод и стабильность мРНК. Профили экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей были исследованы, но стандартные методы для очистки и количественной оценки миРНК в почках мыши не были доступны. Мы создали эффективный и надежный метод извлечения и оценки экспрессии миРНК в почках мыши с почечным интерстициальным фиброзом путем количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR). Протокол требовал пяти этапов: (1) создание фиктивных и односторонних мочеточников (UUO) мышей; (2) извлечение образцов почек у мышей UUO; (3) извлечение общей РНК, которая включает в себя миРНК, из образцов почек; (4) дополнительный синтез ДНК (кДНК) с обратной транскрипцией из миРНК; и (5) qRT-PCR с использованием cDNA. Используя этот протокол, мы успешно подтвердили, что по сравнению с контролем, экспрессия miRNA-3070-3p была значительно увеличена и у миРНК-7218-5p и miRNA-7219-5p были значительно снижены в почках мыши модели почечного интерстициального фиброза. Этот протокол может быть использован для определения экспрессии миРНК в почках мышей с UUO.
Introduction
МикроРНК (миРНК) – короткие, некодирующие РНК, которые вызывают деградацию и транскрипционные ингибирование РНК-мессенджера (мРНК)1 – регулируют выражение различных РНК, которые играют решающую роль как в физиологии, так и в заболеваниях (например, воспаление, фиброз, нарушения обмена веществ и рак). Некоторые из miRNAs поэтому может быть кандидатом новых биомаркеров и терапевтическихцелей для различных заболеваний 2,,3,,4,,5. Хотя профили экспрессии миРНК в органах и тканях мыши, включая мозг, сердце, легкие,печень и почки, были описаны 6,,7,,8,,9,,10,не было никаких стандартных методов для извлечения и оценки миРНК в почках мыши с почечным интерстициальным фиброзом.
Мы разработали протокол для надежной очистки и обнаружения выражений миРНК в почках мышей с почечным интерстициальным фиброзом. Протокол включает в себя пять основных шагов, следующим образом. (1) 8-недельные мыши C57BL/6 разделены на группы мышей, которые проходят фиктивную операцию (контроль) и мышей, которые подвергаются операции, обеспечивающей одностороннее мочеточник (UUO), которая связана с почечным интерстициальным фиброзом. (2) Образцы почек извлекаются из фиктивных и UUO мышей, гомогенизированы отдельно в кремниевом гомогенизаторе, а затем передаются в биополимерную систему измельчения на микроцентрифуге спинаколонки 11,12. (3) Общая РНК, содержащая миРНК извлекается из образцов почек кремнеземной мембраны на основеспина колонке 12,13. (4) Используя эту извлеченную общую РНК, комплементарная ДНК (cDNA) синтезируется из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, поли(A) полимеразы и олиго-ДТгрунтовки 14,15. (5) Выражения миРНК оцениваются по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) с использованием интеркалирующегокрасителя 14,,15.
Этот протокол основан на исследованиях, которые получили значимые извлечения и оценки miRNAs вразличных тканях 11,12,13,14,15,и биополимер-измельчения системы, используемой в протоколе было показано, чтобы очистить высококачественные, общая РНК из тканей в 2006году 12. Кроме того, предыдущие исследования подтвердили точность и чувствительность аспектов протокола (т.е. синтез кДНК с обратной транскриптазой, поли(А) полимеразой и олиго-ДТ праймерами из извлеченной общей РНК) для определения экспрессии миРНК по qRT-PCR с интеркалирующимкрасителем 14,,15. Поскольку новый протокол имеет преимущества простоты, экономии времени и уменьшения технических ошибок, протокол может быть использован в исследованиях, которые требуют точной и чувствительной идентификации профиля miRNA в почках мыши. Кроме того, протокол может быть применен к исследованиям многих патологических состояний.
Затем мы описываем определение профилей экспрессии miRNA у мышей с UUO, который связан с почечным интерстициальным фиброзом. У людей, почечный интерстициальный фиброз является общей и важной особенностью как хронических заболеваний почек и почечной болезни конечной стадии, независимо от ихэтиологии 16,17. Этот почечный интерстициальный фиброз связан с прогрессированием почечной недостаточности, и характеризуется повышенными проявлениями внеклеточных матричных компонентов в интерстициальных пространствах (например, коллагена, фибронектина и α-гладкого мышечного актина)17,,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вышеупомянутый протокол с qRT-PCR успешно определил уровни выражения целевых миРНК. Оценка извлеченных миРНК имеет важное значение при поиске значимых данных qRT-PCR, и для того, чтобы подтвердить качество миРНК перед выполнением qRT-PCR, соотношение поглощения на 260 нм к 280 нм должно быть провер…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мишель Гуди, доктора философии, из Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) за редактирование проекта этой рукописи.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
