一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価
Summary
一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。
Abstract
マイクロRNA(miRNA)は、一本鎖で非コード化されたRNA分子であり、メッセンジャーRNA(mRNA)の3’非翻訳領域(UTR)の部分的に相補的な標的部位に結合することによって転写後レベルで遺伝子発現を調節するのが一般的であり、mRNAの翻訳および安定性を低下させる。マウスの様々な臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルは検討されているが、マウス腎臓におけるmiRNAの精製および定量のための標準的な方法は利用できなかった。我々は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による腎間質線維化によるマウス腎におけるmiRNA発現を抽出し、評価するための効果的かつ信頼できる方法を確立した。このプロトコルには、(1)シャムと一方的な尿管閉塞(UUO)マウスの作成の5つのステップが必要でした。(2) UUOマウスからの腎臓サンプルの抽出;(3) 腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNAの抽出;(4) 相補的 DNA (cDNA) miRNA からの逆転写による合成;(5) cDNAを用いたqRT-PCRを用いた。このプロトコルを用いて、対照と比較してmiRNA-3070-3pの発現が有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が腎間質線維症のマウスモデルの腎臓において有意に減少したことを確認した。このプロトコルは、UUOを有するマウスの腎臓におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。
Introduction
マイクロRNA(miRNA)は、メッセンジャーRNA(mRNA)1の分解および転写阻害を引き起こす短い非コードRNAであり、生理学1と疾患(例えば、炎症、線維症、代謝障害、癌)の両方において重要な役割を果たしている様々なmRNAの発現を調節することが示されている。したがって、miRNAの一部は,、様々な疾患2、3、4、53の新しい2バイオマーカーおよび治療標的の候補である可能性がある。,45脳、心臓、肺、肝臓、腎臓を含むマウスの臓器および組織におけるmiRNA発現プロファイルは66、7、8、9、107,8,9,10と記載されているが、腎間質線維症を有するマウス腎臓におけるmiRNAの抽出および評価のための標準的な方法は存在しなかった。
腎間質線維症を有するマウスの腎臓におけるmiRNAの表現を確実に精製し、検出するプロトコルを設計した。このプロトコルには、次の 5 つの主要な手順が含まれます。(1) 8週齢のC57BL/6雄マウスは、恥ずかし操作(コントロール)を受けるマウスと、腎間質線維症に結合する一方的な尿管閉塞(UUO)を提供する手術を受けるマウスのグループに分けられる。(2)腎臓試料は、シャムマウスとUUOマウスから抽出され、ケイ素ホモジナイザーで別々にホモジナイズされ、次いでマイクロ遠心分離機スピンカラム11,12,12上の生体高分子シュレッディングシステムに移される。(3)miRNAを含む全RNAは、シリカ膜ベースのスピンカラム12、13,13によって腎臓サンプルから抽出される。(4)この抽出された全RNAを用いて、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、及びオリゴdTプライマー14,15,15を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。(5)miRNAの式は、インターカレート色素14,15,15を用いて定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)により評価される。
このプロトコル,は、様々な組織11、12、13、14、15の様々な組織11,12,13,14でmiRNAの有意義な抽出と評価を得た調査に基づいており、プロトコルで使用される生体高分子細断システムは、200612年に組織から高品質の総RNAを精製することが示された。15さらに、以前の研究では、インターカレートダイ14,15を用いてqRT-PCRによるmiRNA発現の測定に用いるプロトコルの側面(すなわち、逆転写酵素によるcDNA合成、ポリ(A)ポリメラーゼ、および抽出された全RNAからのオリゴ-dTプライマー)の正確性と15感度を確認した。新しいプロトコルは、簡便さ、時間節約、および技術的なエラーの削減の利点を有するため、このプロトコルは、マウス腎臓におけるmiRNAプロファイルの正確かつ敏感な同定を必要とする研究に使用することができる。さらに、このプロトコルは、多くの病理学的状態の調査に適用することができる。
次に、腎間質線維症に関連するUUOを有するマウスにおけるmiRNA発現プロファイルの決定について説明する。ヒトにおいて、腎間質線維症は、病因16,17,17に関係なく慢性腎疾患および末期腎疾患の両方の共通かつ重要な特徴である。この腎間質線維症は、腎不全の進行に関連しており、そして間質空間における細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、およびα平滑筋アクチン)17,18,18の表現の増加によって特徴付けられる。
Protocol
Representative Results
Discussion
qRT-PCR を用いた上記のプロトコルは、標的 miRNA の発現レベルを正常に決定しました。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るために重要であり、そしてqRT-PCRを行う前にmiRNAの品質を確認するために、260nmでの吸光度の比率を280nmで分光光度計で確認する必要があります。qRT-PCRでは、予想される長さおよび融点または単一性融解曲線の単一PCR増幅が得られない場合、反応板の各?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エダンツ・グループ(https://en-author-services.edanzgroup.com/)のミシェル・グッディ博士は、この原稿の草稿を編集してくれたことに感謝します。
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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