Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral
Summary
Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.
Abstract
Los microARNas (miRNA) son moléculas de ARN no codificantes de una sola cadena que normalmente regulan la expresión génica a nivel post-transcripción mediante la unión a sitios diana parcialmente complementarios en la región no traducida (UTR) de 3′ de ARN mensajero (ARNm), lo que reduce la traducción y estabilidad del ARNm. Se han investigado los perfiles de expresión de miRNA en varios órganos y tejidos de ratones, pero no se han disponibles métodos estándar para la purificación y cuantificación del miRNA en el riñón de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR). El protocolo requería cinco pasos: (1) creación de ratones falsos y unilaterales de obstrucción ureteral (UUO); (2) extracción de muestras de riñón de los ratones UUO; (3) extracción del ARN total, que incluye miRNA, de las muestras de riñón; (4) síntesis complementaria de ADN (ADNC) con transcripción inversa de miRNA; y (5) qRT-PCR utilizando el ADNc. Usando este protocolo, confirmamos con éxito que en comparación con los controles, la expresión de miRNA-3070-3p se incrementó significativamente y los de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p se redujeron significativamente en los riñones de un modelo de ratón de fibrosis intersticial renal. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miRNA en los riñones de ratones con UUO.
Introduction
Se ha demostrado que los microRNAs (miRNAs) —los ARN cortos que no codifican que causan la degradación y la inhibición transcripcional del ARN mensajero (ARNM)1— regulan la expresión de varios ARNN que tienen funciones cruciales tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer). Por lo tanto, algunos de los miRNAs pueden ser nuevos biomarcadores candidatos y dianas terapéuticas para una variedad de enfermedades2,3,4,5. Aunque se han descrito perfiles de expresión de miRNA en órganos y tejidos de ratón, incluyendo cerebro, corazón, pulmón, hígado y riñón6,7,8,9,10, no ha habido métodos estándar para la extracción y evaluación de miRNAs en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal.
Hemos diseñado un protocolo para purificar y detectar de forma fiable las expresiones de miRNAs en los riñones de ratones con fibrosis intersticial renal. El protocolo implica cinco pasos principales, como se indica a continuación. (1) Los ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad se dividen en grupos de ratones que se someten a una operación falsa (controles) y ratones sometidos a una cirugía que proporciona obstrucción ureteral unilateral (UUO), que está relacionada con la fibrosis intersticial renal. (2) Las muestras de riñón se extraen de los ratones falsos y UUO, se homogeneizan por separado en un homogeneizador de silicio y luego se transfieren a un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de giro de microcentrífuga11,12. (3) El ARN total que contiene miRNA se extrae de las muestras de riñón mediante una columna de espín a base de membrana de sílice12,13. (4) Utilizando este ARN total extraído, el ADN complementario (ADNc) se sintetiza a partir del ARN total con el uso de transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa, y oligo-dT primer14,15. (5) Las expresiones de los miRNas se evalúan mediante una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR) utilizando un tinte intercalante14,15.
Este protocolo se basa en investigaciones que obtuvieron extracciones y evaluaciones significativas de miRNAs en una variedad de tejidos11,12,13,14,15, y el sistema de trituración de biopolímeros utilizado en el protocolo se demostró para purificar arnesón total de alta calidad de los tejidos en 200612. Además, estudios previos han confirmado la exactitud y sensibilidad de los aspectos del protocolo (es decir, la síntesis de ADNc con transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y las imprimaciones oligo-dT del ARN total extraído) para la determinación de la expresión de miRNA por qRT-PCR con un tinte intercalante14,15. Dado que el nuevo protocolo tiene las ventajas de la simplicidad, el ahorro de tiempo y la reducción de errores técnicos, el protocolo se puede utilizar en investigaciones que requieren la identificación precisa y sensible del perfil miRNA en el riñón del ratón. Además, el protocolo podría aplicarse a las investigaciones de muchas condiciones patológicas.
A continuación describimos la determinación de los perfiles de expresión de miRNA en ratones con UUO, que está relacionado con la fibrosis intersticial renal. En los seres humanos, la fibrosis intersticial renal es una característica común e importante tanto de la enfermedad renal crónica como de la enfermedad renal terminal, independientemente de su etiología16,17. Esta fibrosis intersticial renal se asocia con la progresión de la insuficiencia renal, y se caracteriza por el aumento de las expresiones de los componentes de la matriz extracelular en los espacios intersticiales (por ejemplo, colágeno, fibronectina y actina muscular α suave)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito anteriormente con qRT-PCR determinó con éxito los niveles de expresión de los miRNAs de destino. La evaluación de los miRNAs extraídos es importante cuando se trata de obtener datos significativos de qRT-PCR, y con el fin de confirmar la calidad de los miRNAs antes de realizar el qRT-PCR, la relación de absorbancia a 260 nm a la que a 280 nm debe comprobarse con un espectrofotómetro. Si no se puede obtener una sola amplificación de PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión o un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Michelle Goody, PhD, del Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar un borrador de este manuscrito.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
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