Fare Böbreğinde Tek Taraflı Üreteral Obstrüksiyonile MikroRNA Ekspresyonlarının Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Değerlendirilmesi
Summary
Tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol UUO ile farelerde ve diğer patolojik durumlar bağlamında böbrek mikroRNA ekspresyon profillerinin incelenmesi için uygundur.
Abstract
MicroRNA’lar (miRNA’lar), mRNA’nın çevirisini ve stabilitesini azaltan messenger RNA’nın (mRNA) 3′ çevrilmemiş bölgesinde (UTR) kısmen tamamlayıcı hedef bölgelere bağlanarak gen ekspresyonunu transkripsiyon sonrası düzeyde düzenleyen tek iplikli, kodlamayan RNA molekülleridir. Farelerin çeşitli organ ve dokularında miRNA ekspresyonu profilleri araştırılmış, ancak fare böbreğindeki miRNA’nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için standart yöntemler bulunmamaktadır. Fare böbreğinde miRNA ekspresyonunun alınması ve değerlendirilmesi için etkili ve güvenilir bir yöntem oluşturduk. Protokol beş adım gerektiriyordu: (1) sahte ve tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) farelerin yaratılması; (2) UUO farelerböbrek örneklerinin çıkarılması; (3) böbrek örneklerinden miRNA içeren toplam RNA çıkarma; (4) tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi miRNA ters transkripsiyon ile; ve (5) qRT-PCR cDNA kullanarak. Bu protokolü kullanarak, kontrollere göre miRNA-3070-3p ekspresyonunun anlamlı olarak arttığını, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ekspresyonunun renal interstisyel fibrozisin fare modelinin böbreklerinde önemli ölçüde azaldığını başarıyla doğruladık. Bu protokol UUO ile farelerin böbreklerinde miRNA ekspresyonu belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
MikroRNA’lar (miRNA’lar) — haberci RNA’nın (mRNA)1 bozulmasına ve transkripsiyonel inhibisyonuna neden olan kısa, kodlayıcı olmayan RNA’ların, hem fizyolojide hem de hastalıkta (örn. inflamasyon, fibrozis, metabolik bozukluklar ve kanser) önemli rolleri olan çeşitli mRNA’ların ekspresyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Bazı miRNA’lar bu nedenle çeşitlihastalıklariçin aday yeni biyobelirteçler ve tedavi hedefleri 2 ,3,,4,5olabilir. Beyin, kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek gibi fare organlarıve dokularda miRNA ekspresyon profilleri6,7,8,9,10olarak tanımlanmış olmasına rağmen, böbrek interstisyel fibrozisli fare böbreği miRNA’ların çıkarılması ve değerlendirilmesi için standart bir yöntem bulunmamaktadır.6
Renal interstisyel fibrozisli farelerin böbreklerinde miRNA ifadelerini güvenilir bir şekilde arındırmak ve tespit etmek için bir protokol tasarladık. Protokol aşağıdaki gibi beş ana adımdan oluşur. (1) 8 haftalık C57BL/6 erkek fareler, renal interstisyel fibroza bağlı tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) sağlayan bir ameliyata tabi tutulan fare grupları (kontroller) ve farelere ayrılır. (2) Böbrek örnekleri sham ve UUO fareler, bir silikon homogenizer ayrı ayrı homojenize ve daha sonra bir mikrosantrifüj spin sütun11,,12bir biyopolimer parçalama sistemine aktarılır ayıklanır. (3) MiRNA içeren toplam RNA böbrek örneklerinden silika membran tabanlı spin sütun12,13ile elde edilir. (4) Bu çıkarılan toplam RNA kullanılarak, tamamlayıcı DNA (cDNA) ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astar14,15kullanımı ile toplam RNA sentezlenir. (5) miRNA’ların ifadeleri kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)14,15ile incelenir.
Bu protokol, çeşitli dokularda miRNA’ların anlamlı ekstraksiyonve değerlendirmeleri elde edilen araştırmalara dayanmaktadır11,12,13,14,15, ve protokolde kullanılan biyopolimer-parçalama sistemi 2006 yılında dokulardan yüksek kaliteli, toplam RNA arındırmak için gösterilmiştir12. Buna ek olarak, önceki çalışmalar da protokolün yönlerinin doğruluğunu ve hassasiyetini (yani ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astarları ile ekstre toplam RNA) qRT-PCR ile miRNA ekspresyonunun belirlenmesi için ters bir boya14,15. Yeni protokol basitlik, zaman tasarrufu ve teknik hataların azaltılması avantajlarına sahip olduğundan, protokol fare böbreği miRNA profilinin doğru ve hassas bir şekilde tanımlanmasını gerektiren araştırmalarda kullanılabilir. Ayrıca protokol birçok patolojik durum la ilgili araştırmalara da uygulanabilir.
Daha sonra uuo ile farelerde miRNA ekspresyon profillerinin belirlenmesi ni açıklayacağız, bu da renal interstisyel fibrozis ile bağlantılıdır. İnsanlarda renal interstisyel fibrozis hem kronik böbrek hastalığının hem de son dönem böbrek hastalıklarının16,17yaygın ve önemli bir özelliğidir. Bu renal interstisyel fibrozis böbrek yetmezliğinin ilerlemesi ile ilişkilidir, ve interstisyel alanlarda ekstrasellüler matriks bileşenlerinin artan ekspresyonları ile karakterizedir (örneğin, kollajen, fibronektin, ve α-düz kas aktin)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
QRT-PCR ile yukarıda açıklanan protokol, hedeflenen miRNA’ların ifade düzeylerini başarıyla belirlemiştir. Anlamlı qRT-PCR verileri elde etmek isteyen ayıklanmış miRNA’ların değerlendirilmesi önemlidir ve qRT-PCR’yi gerçekleştirmeden önce miRNA’ların kalitesini doğrulamak için 260 nm’deki absorbans oranı 280 nm’de spektrofotometre ile kontrol edilmelidir. Beklenen uzunluk ve erime sıcaklığının tek bir PCR amplifikasyonu veya monomodal erime eğrisi qRT-PCR ile elde edilemiyorsa, reaksiyon plaka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Edanz Group’tan (https://en-author-services.edanzgroup.com/) Bu el yazmasının taslağını düzenlediği için Doktora lı Michelle Goody’e teşekkür ederiz.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
