Kwantitatieve real-time PCR-evaluatie van microRNA-expressies in muisnier met eenzijdige ureterale obstructie
Summary
We beschrijven een methode voor het evalueren van de microRNA-expressie in de nieren van muizen met eenzijdige ureterale obstructie (UUO) door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van niermicroRNA expressieprofielen bij muizen met UUO en in de context van andere pathologische aandoeningen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn enkelstrengse, niet-coderende RNA-moleculen die doorgaans genexpressie op posttrantieniveau reguleren door zich te binden aan gedeeltelijk complementaire doellocaties in de onvertaalde regio 3 (UTR) van messenger RNA (mRNA), wat de vertaling en stabiliteit van het mRNA vermindert. De miRNA-expressieprofielen in verschillende organen en weefsels van muizen zijn onderzocht, maar standaardmethoden voor de zuivering en kwantificering van miRNA in de muizennier zijn niet beschikbaar. We hebben een effectieve en betrouwbare methode voor het extraheren en evalueren van miRNA expressie in de muis nier met nier interstitiële fibrose door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR). Het protocol vereiste vijf stappen: (1) creatie van schijn en eenzijdige ureterale obstructie (UUO) muizen; (2) extractie van niermonsters van de UUO-muizen; (3) extractie van het totale RNA, waaronder miRNA, uit de niermonsters; (4) aanvullende DNA-synthese (cDNA) met omgekeerde transcriptie van miRNA; en (5) qRT-PCR met behulp van de cDNA. Met behulp van dit protocol hebben we met succes bevestigd dat in vergelijking met de controles, de expressie van miRNA-3070-3p aanzienlijk werd verhoogd en die van miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p aanzienlijk zijn afgenomen in de nieren van een muismodel van nierinterstitial fibrose. Dit protocol kan worden gebruikt om de miRNA-expressie in de nieren van muizen met UUO te bepalen.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) — de korte, niet-coderende RNAs die de afbraak en transcriptieremming van messenger RNA (mRNA)1 veroorzaken – is aangetoond dat ze de expressie reguleren van verschillende mRNAs die een cruciale rol spelen in zowel fysiologie als ziekte (bijvoorbeeld ontsteking, fibrose, metabole stoornissen en kanker). Sommige miRNAs kunnen daarom kandidaat-nieuwe biomarkers en therapeutische doelstellingen zijn voor een verscheidenheid aan ziekten2,3,4,5. Hoewel miRNA-expressieprofielen in muisorganen en weefsels, waaronder hersenen, hart, long, lever en nieren zijn beschreven6,7,8,9,10, zijn er geen standaardmethoden voor de extractie en evaluatie van miRNAs in de muizennier met nierintermale fibrose.
We hebben een protocol ontworpen om de uitdrukkingen van miRNAs in de nieren van muizen met nierinterstitial fibrose betrouwbaar te zuiveren en te detecteren. Het protocol omvat vijf belangrijke stappen, als volgt. (1) 8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen zijn verdeeld in groepen muizen die een schijnoperatie ondergaan (controles) en muizen die worden onderworpen aan een operatie die eenzijdige ureterale obstructie (UUO) biedt, die verband houdt met nierinterstitial fibrose. (2) Niermonsters worden gewonnen uit de sham- en UUO-muizen, afzonderlijk gehomogeniseerd in een siliciumhomogenisator en vervolgens overgebracht naar een biopolymeerversnippersysteem op een microcentrifugespinkolom11,12. (3) Het totale RNA dat miRNA bevat, wordt uit de niermonsters gehaald door een spinkolom op basis van silicamembraan op basis van12,13. (4) Met behulp van dit totale RNA wordt aanvullend DNA (cDNA) gesynthetiseerd uit het totale RNA met behulp van reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT primer14,15. (5) De uitdrukkingen van miRNA’s worden beoordeeld door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) met behulp van een intercalating kleurstof14,15.
Dit protocol is gebaseerd op onderzoeken die zinvolle extracties en evaluaties van miRNAs in verschillende weefsels11,12,,13,14,15, en de biopolymeer-shredder systeem gebruikt in het protocol werd aangetoond dat hoge kwaliteit, totale RNA zuiveren uit weefsels in 200612. Bovendien hebben eerdere studies de nauwkeurigheid en gevoeligheid van aspecten van het protocol bevestigd (d.w.z. de cDNA-synthese met reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT-primers uit geëxtraheerd totaal RNA) voor de bepaling van miRNA-expressie door qRT-PCR met een intercalating dye14,15. Aangezien het nieuwe protocol de voordelen heeft van eenvoud, tijdbesparing en het verminderen van technische fouten, kan het protocol worden gebruikt in onderzoek dat de nauwkeurige en gevoelige identificatie van het miRNA-profiel in de muisnier vereist. Bovendien zou het protocol kunnen worden toegepast op onderzoeken naar vele pathologische omstandigheden.
Vervolgens beschrijven we de bepaling van de miRNA expressieprofielen in muizen met UUO, die gekoppeld is aan nierinterstitial fibrose. Bij mensen is nierinterstitial fibrose een gemeenschappelijk en belangrijk kenmerk van zowel chronische nierziekte als eindstadium nierziekte, ongeacht hun etiologie16,17. Deze nierstitial fibrose wordt geassocieerd met de progressie van nierfalen, en het wordt gekenmerkt door verhoogde expressies van extracellulaire matrixcomponenten in de interstitiële ruimten (bijvoorbeeld collageen, fibronectine en α gladde spieractine)17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierboven beschreven protocol met qRT-PCR heeft met succes de expressieniveaus van de beoogde miRNAs bepaald. De beoordeling van geëxtraheerde miRNAs is belangrijk bij het verkrijgen van zinvolle qRT-PCR-gegevens, en om de kwaliteit van de miRNAs te bevestigen voordat de qRT-PCR wordt uitgevoerd, moet de absorptieverhouding van 260 nm tot die bij 280 nm worden gecontroleerd met een spectrofotometer. Als een enkele PCR-versterking van de verwachte lengte en smelttemperatuur of een monomodale smeltcurve niet kan worde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Michelle Goody, PhD, van Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
