Summary

Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken

Published: April 17, 2020
doi:

Summary

Die Generierung rekombinanter Rotaviren aus Plasmid-DNA ist ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der Rotavirus-Replikation und Pathogenese sowie für die Entwicklung von Rotavirus-Expressionsvektoren und Impfstoffen. Hierin beschreiben wir einen vereinfachten Reverse-Genetik-Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, einschließlich Stämmen, die fluoreszierende Reporterproteine exdrücken.

Abstract

Rotaviren sind eine große und sich entwickelnde Population segmentierter doppelsträngiger RNA-Viren, die bei vielen Säugetier- und Vogelwirtarten, einschließlich des Menschen, eine schwere Gastroenteritis verursachen. Mit dem jüngsten Aufkommen von Rotavirus-Reverse-Genetik-Systemen ist es möglich geworden, gezielte Mutagenese zu verwenden, um die Rotavirusbiologie zu erforschen, bestehende Rotavirus-Impfstoffe zu modifizieren und zu optimieren und Rotavirus-Multitarget-Impfstoffvektoren zu entwickeln. In diesem Bericht beschreiben wir ein vereinfachtes Reverse-Genetik-System, das die effiziente und zuverlässige Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren ermöglicht. Das System basiert auf der Kotransfektion von T7-Transkriptionsvektoren, die Rotavirus (+)RNAs exdrücken, und einem CMV-Vektor, der ein RNA-Verschlussenzym in BHK-Zellen kodiert, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) produzieren. Rekombinante Rotaviren werden verstärkt, indem die transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen übersaat werden, einer Affen-Nierenzelllinie, die für das Viruswachstum sehr freizügig ist. In diesem Bericht beschreiben wir auch einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Rotaviren, die durch die Einführung eines 2A-Translational Stop-Restart-Elements in das Genomsegment 7 (NSP3) ein separates fluoreszierendes Reporterprotein ausdrücken. Dieser Ansatz vermeidet das Löschen oder Ändern eines der viralen offenen Leserahmen und ermöglicht so die Produktion rekombinanter Rotaviren, die voll funktionsfähige virale Proteine behalten und gleichzeitig ein fluoreszierendes Protein exezieren.

Introduction

Rotaviren sind Hauptursachen für schwere Gastroenteritis bei Säuglingen und Kleinkindern, sowie bei vielen anderen Säugetier- und Vogelarten1. Als Mitglieder der Reoviridae-Familie haben Rotaviren ein segmentiertes doppelsträngiges RNA-Genom (dsRNA). Die Genomsegmente sind in einem nicht umhüllten ikosaedralen Virion enthalten, das aus drei konzentrischen Schichten des Proteins2gebildet wird. Basierend auf der Sequenzierung und phylogenetischen Analyse der Genomsegmente wurden neun Arten von Rotavirus (A-D, F-J) definiert3. Die Stämme, die Rotavirus-Arten A umfassen, sind für die überwiegende Mehrheit der menschlichen Krankheit verantwortlich4. Die Einführung von Rotavirus-Impfstoffen in Impfprogramme für Kinder, die in den letzten zehn Jahren begonnen haben, korreliert mit einer signifikanten Verringerung der Sterblichkeit und Morbidität von Rotavirus. Vor allem ist die Zahl der Rotavirus-assoziierten Todesfälle im Kindesalter von etwa 528.000 im Jahr 2000 auf 128.500 im Jahr 2016gesunken 4,5. Rotavirus-Impfstoffe werden aus lebenden abgeschwächten Stämmen des Virus formuliert, wobei 2 bis 3 Dosen kindern im Alter von 6 Monaten verabreicht werden. Die große Anzahl genetisch unterschiedlicher Rotavirusstämme, die bei Menschen und anderen Säugetierarten zirkulieren, in Verbindung mit ihrer Fähigkeit, sich durch Mutagenese und Neusortierung schnell zu entwickeln, können zu antigenen Veränderungen in den Arten von Rotaviren führen, die Kinder6,7,8infizieren. Solche Änderungen können die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe untergraben, die deren Ersatz oder Änderung erfordern.

Die Entwicklung vollständig plasmidbasierter Reverse-Genetik-Systeme, die die Manipulation eines der 11 Rotavirus-Genomsegmente ermöglichen, wurde erst vor kurzem erreicht9. Mit der Verfügbarkeit dieser Systeme ist es möglich geworden, molekulare Details der Rotavirusreplikation und Pathogenese zu entwirren, verbesserte Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Anti-Rotavirus-Verbindungen zu entwickeln und neue potenziell effektivere Klassen von Rotavirus-Impfstoffen zu schaffen. Während der Rotavirus-Replikation leiten gekappte virale (+)RNAs nicht nur die Synthese viraler Proteine, sondern dienen auch als Vorlagen für die Synthese von Nachkommen dsRNA-Genomsegmenten10,11. Alle bisher beschriebenen Rotavirus-Reverse-Genetik-Systeme stützen sich auf die Transfektion von T7-Transkriptionsvektoren in Säugetierzelllinien als Quelle von cDNA-abgeleiteten (+)RNAs, die bei der Wiederherstellung rekombinanter Viren9,12,13verwendet werden. Innerhalb der Transkriptionsvektoren werden virale cDNAs in voller Länge zwischen einem vorgelagerten T7-Promotor und einem nachgeschalteten Hepatitis-Delta-Virus (HDV)-Ribozym positioniert, so dass virale (+)RNAs durch T7-RNA-Polymerase synthetisiert werden, die authentische 5′ und 3′-termini enthalten (Abbildung 1A). Im Reverse-Genetik-System der ersten Generation wurden rekombinante Viren durch Transfizierung von Babyhamster-Nierenzellen hergestellt, die T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) mit 11 T7 (pT7) Transkriptionsvektoren exdrücken, jede direkte Synthese einer einzigartigen (+)RNA des simians SA11-Virusstamms und drei CMV-Promotor-Antriebsexpressionsplasmiden, eines kodiert das Aviäre Reovirus p10FAST-Fusionsprotein und zwei kodierende Untereinheiten des Impfvirus D1R-D12L-Verschluss-Enzymkomplexes9. Rekombinante SA11-Viren, die in transfizierten BHK-T7-Zellen erzeugt wurden, wurden durch Übersaat mit MA104-Zellen verstärkt, einer Zelllinie, die für das Wachstum des Rotavirus freiist. Es wurde eine modifizierte Version des Reverse-Genetik-Systems der ersten Generation beschrieben, die keine Unterstützungplasmide mehr verwendet12. Stattdessen erzeugt das modifizierte System erfolgreich rekombinante Rotaviren, indem es BHK-T7-Zellen mit den 11 SA11 T7 Transkriptionsvektoren transfiziert, wobei der Vorbehalt besteht, dass Vektoren für die Bausteine der viralen Fabrik (Viroplasma) (nichtstrukturelle Proteine NSP2 und NSP5) auf Ebenen hinzugefügt werden, die 3-fach höher sind als die anderen Vektoren14,15. Modifizierte Versionen des Reverse-Genetik-Systems wurden auch entwickelt, die die Wiederherstellung der menschlichen KU- und Odelia-Stämme des Rotavirus16,17unterstützen. Das Rotavirus-Genom ist bemerkenswert anfällig für Manipulationen durch umgekehrte Genetik, mit rekombinanten Viren, die bisher mit Mutationen in VP418,NSP19, NSP219, NSP320,21und NSP522,23eingeführt wurden. Zu den nützlichsten Viren, die bisher erzeugt wurden, gehören diejenigen, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Reporterproteine (FPs)auszudrücken 9,12,21,24,25.

In dieser Publikation stellen wir das Protokoll für das Reverse-Genetik-System zur Verfügung, das wir in unserem Labor verwenden, um rekombinante Stämme von SA11-Rotavirus zu erzeugen. Das Hauptmerkmal unseres Protokolls ist die Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit den 11 pT7 Transkriptionsvektoren (modifiziert um 3x Ebenen des pT7/NSP2SA11 und pT7/NSP5SA11-Vektors) und eines CMV-Expressionsvektors, der das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) NP868R-Verschlussenzym21 (Abbildung 2) kodiert. In unseren Händen führt das Vorhandensein des NP868R-Plasmids zur Produktion von höheren Tittern rekombinanter Viren durch transfizierte BHK-T7-Zellen. In dieser Publikation stellen wir auch ein Protokoll zur Änderung des pT7/NSP3SA11-Plasmids bereit, so dass rekombinante Viren erzeugt werden können, die nicht nur das Segment 7-Proteinprodukt NSP3, sondern auch ein separates FP ausdrücken. Dies wird erreicht, indem der NSP3-Leserahmen (ORF) im pT7/NSP3SA11-Plasmid neu gestaltet wird, um ein nachgeschaltetes 2A-Translational Stop-Restart-Element gefolgt von einem FP ORF (Abbildung 1B)24,26. Durch diesen Ansatz haben wir rekombinante Rotaviren erzeugt, die verschiedene FpPs exdrücken: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)24,27,28. Diese FP-exemitten Rotaviren werden ohne Löschung des NSP3 ORF hergestellt, wodurch Viren entstehen, von denen erwartet wird, dass sie eine vollständige Ergänzung funktionierender viraler Proteine kodieren.

Protocol

1. Medienaufbereitung und Zellkulturpflege Erhalten Sie Babyhamster-Nierenzellen, die konstitutiv T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) und afrikanische grüne Affennieren-MA104-Zellen exemiten.HINWEIS: BHK-T7 (oder BSR-T7) Zellen sind nicht kommerziell erhältlich, sondern sind eine gemeinsame Zelllinie von Laboratorien, die Umgekehrte Genetik verwenden, um die RNA-Virusbiologie zu untersuchen. Die in diesem Protokoll verwendete BHK-T7-Zelllinie wurde von Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesd…

Representative Results

Das in diesem Artikel beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll führt mehrere verschiedene Schritte durch: (1) Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit Rotavirus pT7-Transkriptionsvektoren und einem pCMV/NP868R-Expressionsplasmid, (2) Übersaat von transfizierten BHK-T7-Zellen mit MA104-Zellen, (3) Amplifikation rekombinanter Viren in BHK-T7/MA104-Zellen lysiert mit MA104-Zellen und (4) Plaque-Isolierung des rekombinanten Virus mit MA104-Zellen (Abbildung 2). In unseren Händen ist das Protokoll …

Discussion

In unserem Labor verlassen wir uns routinemäßig auf das hier beschriebene Reverse-Genetik-Protokoll, um rekombinante SA11-Rotaviren zu produzieren. Mit diesem Ansatz erholen sich Personen mit wenig Erfahrung in molekularbiologischen Techniken oder der Arbeit mit Rotaviren rekombinante Viren auch beim ersten Versuch. Wir haben nach diesem Protokoll fast 100 rekombinante Viren erzeugt, einschließlich derer mit Genomen, die überarbeitet wurden, um fremde Proteine (z. B. FPs) auszudrücken, die Sequenzadditionen, Löschu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R03 AI131072 und R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding und das Lawrence M. Blatt Endowment unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Labors der IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, und Guido Papa für ihre vielen Beiträge und Anregungen bei der Entwicklung des Reverse Genetics Protokolls.

Materials

Baby Hamster Kidney – T7 RdRP (BHK-T7) Cells Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov
Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Bio-Rad 45608105
Cellometer AutoT4 viable cell counter Nexcelom
ChemiDoc MP Gel Imaging System Bio-Rad
Chloroform MP 194002
Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate Bio-Rad 170-5060
Competent E.coli DH5alpha Bacteria Lucigen 60602-2
Complete Protease Inhibitor Pierce A32965
Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips MTC Bio P4113-11
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Lonza 12-604F
Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) Quality Biological 115-073-101
Ethanol, Absolute (200 proof) Fisher Bioreagents BP2818-500
Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) Invitrogen 15585-011
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Corning 35-011-CV
Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal Sigma-Aldrich F1804
GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit Sigma NA0200-1KT
Geneticin (G-418) Invitrogen 10131-027
Gibco FluroBrite DMEM ThermoFisher A1896701 DMEM with low background fluorescence
Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) Gibco 11710-035
Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7074S
Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum Patton lab lot 55068
Guinea Pig Anti-VP6 Antierum Patton lab lot 53963
Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated KPL 5220-0366
Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated Cell-Signaling Technology 7076S
iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit JH Science 25235
Isopropyl alcohol Macron 3032-02
L-glutamine Solution (100x) Gibco 25030-081
Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) RPI research products L24020-2000.0
Medium 199 (M199) Culture Medium Hyclone Sh30253.01
Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) Lonza 04-719Q
Monkey Kidney (MA104) Cells ATCC ATCC CRL-2378.1
NanoDrop One Spectrophotometer ThermoScientific
Neutral Red Solution (0.33%) Sigma-Aldrich N2889-100ml
Non-Essential Amino Acid Solution (100x) Gibco 11140-050
Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel Invitrogen XP00102BOX
Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water Invitrogen 10977-015
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit Takara 740609.25
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985-070
Pellet pestle (RNase-free, disposable) Fisher 12-141-368
Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) Corning 30-002-Cl
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Bioreagents BP399-20
Porcine Trypsin, Type IX-S Sigma-Aldrich T0303
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen 12162
Qiagen Plasmid Midi Kit Qiagen 12143
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
SA11 pT7 Transcription Vectors Addgene 89162-89172
SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins Contact: jtpatton@iu.edu
SeaKem LE Agarose Lonza 50000 For gel electrophoresis
SeaPlaque agarose Lonza 50100 For plaque assay
Superscript III One-Step RT-PCR kit Invitrogen 12574-035
Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 170-4270
Trans-Llot Turbo Transfer System Bio-Rad
TransIT-LTI Transfection Reagent Mirus MIR2306
Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) Bio-Rad 161-0772
Triton X 100 Fisher Bioreagents BP151-500
Trizol RNA Extraction Reagent Ambion 15596026
Trypan blue Corning 25-900-CI
Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution Quality Biological 118-087-721
Tryptose Phosphate Broth Gibco 18050-039
Tween-20 VWR 0777-1L
Vertrel VF solvent Zoro G0707178
Zoe Fluorescent Live Cell Imager Bio-Rad

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Cite This Article
Philip, A. A., Dai, J., Katen, S. P., Patton, J. T. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (158), e61039, doi:10.3791/61039 (2020).

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