Método de Genética Inversa Simplificada para Recuperar Rotavirus Recombinantes Expresando Proteínas Reportero

Los rotavirus son las principales causas de gastroenteritis grave en lactantes y niños pequeños, así como en los jóvenes de muchas otras especies de mamíferos y aves¹. Como miembros de la familia Reoviridae, los rotavirus tienen un genoma segmentado de ARN de doble cadena (dsRNA). Los segmentos del genoma están contenidos dentro de un virión icosahedral no envuelto formado a partir de tres capas concéntricas de proteína^2. Sobre la base de la secuenciación y el análisis filogenético de los segmentos del genoma, se han definido nueve especies de rotavirus (A-D, F-J)³. Esas cepas que comprenden la especie de rotavirus A son responsables de la gran mayoría de las enfermedades humanas^4. La introducción de vacunas contra el rotavirus en los programas de inmunización infantil a partir de la última década está correlacionada con reducciones significativas en la mortalidad y la morbilidad del rotavirus. En particular, el número de muertes infantiles asociadas al rotavirus ha disminuido de aproximadamente 528.000 en 2000 a 128.500 en 2016^4,5. Las vacunas contra el rotavirus se formulan a partir de cepas vivas atenuadas del virus, con 2 a 3 dosis administradas a niños a los 6 meses de edad. El gran número de cepas de rotavirus genéticamente diversas que circulan en humanos y otras especies de mamíferos, combinadas con su capacidad de evolucionar rápidamente a través de la mutagénesis y el reordenamiento, puede dar lugar a cambios antigénicos en los tipos de rotavirus que infectan a niños^6,7,8. Estos cambios pueden socavar la eficacia de las vacunas existentes, lo que requiere su sustitución o modificación.

El desarrollo de sistemas de genética inversa totalmente basados en plásmidos que permiten la manipulación de cualquiera de los 11 segmentos del genoma del rotavirus se logró recientemente⁹. Con la disponibilidad de estos sistemas, se ha hecho posible desentrañar los detalles moleculares de la replicación del rotavirus y la patogénesis, desarrollar métodos mejorados de detección de alto rendimiento para los compuestos anti-rotavirus y crear nuevas clases potencialmente más eficaces de vacunas contra el rotavirus. Durante la replicación del rotavirus, los arnvirales (+)ARN no sólo guían la síntesis de proteínas virales, sino que también sirven como plantillas para la síntesis de la progenie dsRNA genome segmentos^10,11. Todos los sistemas de genética inversa rotavirus descritos hasta la fecha se basan en la transfección de vectores de transcripción T7 en líneas celulares de mamíferos como fuente de ARN derivados del ADNC (+)ARN utilizados en la recuperación de virus recombinantes^9,12,13. Dentro de los vectores de transcripción, los cDNa virales de longitud completa se colocan entre un promotor t7 ascendente y el ribozyme del virus delta de la hepatitis (HDV) aguas abajo, de tal manera que los virales (+)ARN son sintetizados por la polimerasa de ARN T7 que contienen 5′ y 3′-termini auténticos (Figura 1A). En el sistema de genética inversa de primera generación, los virus recombinantes se hicieron transfectando células renales de hámster bebé que expresaban la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7) con 11 vectores de transcripción T7 (pT7), cada síntesis de dirección de un ARN único (+)de la cepa del virus SA11 simio, y tres plásmidos de expresión promotor-drive promotor de CMV, uno que codifica la proteína de fusión reovirus aviar p10FAST y dos subunidades codificantes del complejo de enzimas de tapado del virus de la vacuna D1R-D12L⁹. Los virus SA11 recombinantes generados en células BHK-T7 transinfectadas se amplificaron mediante la sustitución con células MA104, una línea celular permisiva para el crecimiento del rotavirus. Se ha descrito una versión modificada del sistema de genética inversa de primera generación que ya no utiliza plásmidos de soporte¹². En su lugar, el sistema modificado genera con éxito rotavirus recombinantes simplemente transfectando células BHK-T7 con los 11 vectores de transcripción SA11 T7, con la advertencia de que los vectores para la fábrica viral (viroplasmo) bloques de construcción (proteínas no estructurales NSP2 y NSP5) se añaden a niveles 3 veces más altos que los otros vectores^14,15. También se han desarrollado versiones modificadas del sistema de genética inversa que apoyan la recuperación de las cepas humanas KU y Odelia del rotavirus^16,,17. El genoma del rotavirus es notablemente susceptible de manipulación por genética inversa, con virus recombinantes generados hasta la fecha con mutaciones introducidas en VP4^18,NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,,21y NSP5^22,,23. Entre los virus más útiles generados hasta el momento se encuentran los que han sido diseñados para expresar proteínas de reportero fluorescente (FP)^{9,,12,,21,24,25}.

En esta publicación, proporcionamos el protocolo para el sistema de genética inversa que utilizamos en nuestro laboratorio para generar cepas recombinantes de rotavirus SA11. La característica clave de nuestro protocolo es la co-transfección de células BHK-T7 con los vectores de transcripción 11 pT7 (modificados para incluir niveles 3x de los vectores pT7/NSP2SA11 y pT7/NSP5SA11) y un vector de expresión CMV que codifica la^enzima np868R(Figura 2). En nuestras manos, la presencia del plásmido NP868R conduce a la producción de tetas más altas de virus recombinantes por células BHK-T7 transinfectadas. En esta publicación, también proporcionamos un protocolo para modificar el plásmido pT7/NSP3SA11 de tal manera que se puedan generar virus recombinantes que expresen no sólo el producto proteico del segmento 7 NSP3, sino también un FP separado. Esto se logra reingeniería el marco de lectura abierta (ORF) NSP3 en el plásmido pT7/NSP3SA11 para contener un elemento de detención-reinicio traslacional 2A descendente seguido de un FP ORF (Figura 1B)^24,26. A través de este enfoque, hemos generado rotavirus recombinantes que expresan varios FP: UnaG (verde), mKate (rojo lejano), mRuby (rojo), TagBFP (azul), CFP (cian) y YFP (amarillo)^24,,27,28. Estos rotavirus de expresión de FP se fabrican sin eliminar el NSP3 ORF, produciendo así virus que se espera que codifican un complemento completo de proteínas virales que funcionan.