レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

ロタウイルスは、乳幼児の重度の胃腸炎の主な原因であり、他の多くの哺乳類および鳥類の若者^1.レオビリダ科の一員として、ロタウイルスはセグメント化された二本鎖RNA(dsRNA)ゲノムを有する。ゲノムセグメントは、タンパク質²の3つの同心層から形成された非エンベロープ二面体のビリオン内に含まれている。ゲノムセグメントのシーケンシングと系統解析に基づいて、9種のロタウイルス(A-D、F-J)が^{定義されている。}ロタウイルス種Aを含む株は、ヒト疾患⁴の大多数を担っている。過去10年間に始まった小児予防接種プログラムへのロタウイルスワクチンの導入は、ロタウイルスの死亡率および罹患率の有意な減少と相関している。最も顕著なのは、ロタウイルス関連の小児死亡率は、2000年の約528,000人から2016年には128,500人に減少した^。,5ロタウイルスワクチンは、生きたウイルスの弱化株から処方され、生後6ヶ月までに小児に2〜3回投与される。ヒトおよび他の哺乳類種で循環する多数の遺伝的に多様なロタウイルス株は、突然変異および再分類を通じて急速に進化する能力と相まって、小児^{66、7、87,8}に感染するロタウイルスの種類の抗原性変化を招く可能性がある。このような変化は、既存のワクチンの有効性を損ない、その交換または改変を必要とする可能性がある。

11個のロタウイルスゲノムセグメントの操作を可能にする完全プラスミドベースの逆遺伝学系の開発は、最近^{になってようやく達成された。}これらのシステムの利用により、ロタウイルス複製および病因の分子詳細を解明し、抗ロタウイルス化合物の高スループットスクリーニング方法を開発し、ロタウイルスワクチンの新しい潜在的に効果的なクラスを作成することが可能になりました。ロタウイルス複製の間、制限されたウイルス(+)RNAは、ウイルスタンパク質の合成を導くだけでなく、子孫のdsRNAゲノムセグメント^10、11,11の合成のためのテンプレートとしても役立つ。これまでに記載されたすべてのロタウイルス逆遺伝学系は、組換えウイルス^9、12、13,の回収に使用されるcDNA由来(+)RNAの供給源として、T7転写ベクターを哺乳動物細胞株に^9,トランスフェクションすることに依存している。¹³転写ベクター内では、フルレングスのウイルスcRNAは、ウイルス(+)RNAが本物の5’および3’末語を含むT7 RNAポリメラーゼによって合成されるような上流T7プロモーターと下流型肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムの間に位置付けられている(図1A)。第1世代逆遺伝学系では、T7RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を11T7(pT7)転写ベクターで発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞をトランスフェクトすることにより組換えウイルスが作られた、 各各々は、シミアンSA11ウイルス株のユニークな(+)RNAの合成、及び3つのCMVプロモーター駆動発現プラスミド、1つはワクシニアウイルスD1R-D12Lキャッピング酵素複合体⁹のアビアンレオウイルスp10FAST融合タンパク質および2つのコード化サブユニットをコードする。トランスフェクトされたBHK-T7細胞で生成された組換えSA11ウイルスは、MA104細胞とのオーバーシードにより増幅され、ロタウイルス増殖に対する細胞株透過性である。第1世代リバース遺伝学系の改変版は、もはや支持プラスミド¹²を使用していないと述べてきた。代わりに、改変系は、11個のSA11 T7転写ベクターを用いてBHK-T7細胞をトランスフェクトするだけで組み換えロタウイルスを生成することに成功し、ウイルス工場(viroplasm)ビルディングブロック(非構造タンパク質NSP2およびNSP5)のベクターが他のベクターよりも3倍高いレベルで追加されるという^14,警告^がある。逆遺伝学システムの改変バージョンは、ロタウイルス^16、17,17のヒトKUおよびオデリア株の回復をサポートするも開発されている。ロタウイルスゲノムは、逆遺伝学による操作に非常に適しており、VP4^{18、NSP19、NSP219、NSP3,}20、21、およびNSP5^20,2122、23に導入された変異を伴ってこれまでに生成された組換えウイルスを有する。²³これまでに生成された最も有用なウイルスの中には、蛍光レポータータンパク質^{(F)9、12、21、24、2512,21,24,25}を発現するように設計されたものがある。⁹

本稿では、我々の研究室で使用する逆遺伝学システムのプロトコルを提供し、SA11ロタウイルスの組換え株を生成する。我々のプロトコルの主な特徴は、BHK-T7細胞を11 pT7転写ベクター(pT7/NSP2SA11およびpT7/NSP5SA11ベクターの3倍のレベルを含むように改変した)およびアフリカの豚熱ウイルス(ASFV)NP868Rキャッピング酵素をコードするCMV発現ベクターである²¹⁽我々の手では、NP868Rプラスミドの存在は、トランスフェクトされたBHK-T7細胞による組換えウイルスのより高い強化剤の産生をもたらす。本稿では、セグメント7タンパク質産物NSP3だけでなく、別のFPを発現する組換えウイルスを生成できるよう、pT7/NSP3SA11プラスミドを改変するためのプロトコルも提供する。これは、pT7/NSP3SA11プラスミドのNSP3オープンリーディングフレーム(ORF)を再設計し、下流の2Aトランスレーショナルストップリスタート要素を含み^、続いてFP ORF(図1B)24、26を含むことによって達成^される。²⁴このアプローチを通じて、UnaG(緑)、mKate(ファーレッド)、mRuby(赤)、タグBFP(青)、CFP(シアン)、YFP(黄色^{)24、27、28,27}など、さまざまなFPを発現する組み換えロタウイルス^を28生成しました。これらのFP発現ロタウイルスは、NSP3 ORFを削除することなく作られ、機能するウイルスタンパク質の完全な補完をコードすると予想されるウイルスを生み出す。